罗青春 ，赵 东 ，2，乔宗伟 ，2，郑 佳 ，2

（1.宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644007； 2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾644007)

浓香型白酒作为四大香型白酒之一，在我国白酒行业中占有举足轻重的地位。众所周知，白酒品质及风格往往是由各种风味物质的含量与比例关系所决定。优质浓香型白酒中，四大酯类的比例为己酸乙酯＞乳酸乙酯＞乙酸乙酯＞丁酸乙酯[1]。而杂醇油是白酒中最重要的三大芳香组分之一，是3个碳以上的一元醇类物质的总称，其主要成分是正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇等高级醇[2]。但是，如果白酒中杂醇油含量过高，对人体有毒害作用，它对人体的中毒和麻醉作用比乙醇强，能使神经系统充血，使人感觉头疼。它还是白酒苦味和涩味的主要来源之一，同时也是造成白酒出现白色浑浊的原因之一[3-4]。

目前研究中，关于降解正丙醇的报道非常少，罗惠波等[5]通过在大曲中添加糖化酶，结果正丙醇含量随糖化酶增加有小幅度的增加，可能是由于糖化酶能把淀粉从非还原性末端水解断裂α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键产生葡萄糖，而添加糖化酶后，加速了淀粉水解速度，使可被酵母直接利用的葡萄糖浓度增加，酵母会加速对糖分的代谢，而减少了对氨基酸的降解代谢，降低了正丙醇的产生量。而关于正丙醇降解菌的筛选还未见报道。

本研究从窖泥中筛选出1株正丙醇降解菌，经形态学和16S rDNA测序分析鉴定为放线菌中的原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)。这对浓香型白酒降低杂醇油提供了一种新的菌株，也对放线菌在窖泥中的功能有了新的认识。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 窖泥

实验样品采集：样品取自宜宾五粮液股份有限公司窖龄为20年窖池的窖底泥，窖池分别在窖底4个角落和接近中心点的一点各取1个样，每个样品重量约100 g，在无菌袋中混匀后立即使用。

1.1.2 培养基

富集培养基：NaCl 1.0 g、K2HPO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、MgCl20.5 g、NaNO31.0 g、葡萄糖 2 g，溶于500 mL蒸馏水中，酒糟20 g、黄水10 mL、曲粉6 g、酒尾20 mL，溶于500 mL蒸馏水中搅动半小时后用8层纱布过滤，再混合后用1 mol/L NaOH调节pH值至6.5～7.0。

无机盐培养基：MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、6.67 g/L CaCl23.0 mL、17 g/L FeCl33.0 mL、Fe-SO4·7H2O 0.05 g、NaNO31.0 g、不同浓度正丙醇(唯一碳源)、1000 mL蒸馏水。

保藏培养基：MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、6.67 g/L CaCl23.0 mL、17 g/L FeCl33.0 mL、FeSO4·7H2O 0.05 g、NaNO31.0 g、酵母浸粉 2.0 g、1000 mL蒸馏水。

1.1.3 试剂与仪器

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物)，SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒(上海生工生物)，气相色谱仪(Agilent)。

1.2 实验方法

1.2.1 正丙醇降解菌的筛选

1.2.1.1 富集培养

将窖泥样品，以5%的接种量接种于含正丙醇4 g/L的富集培养基，30℃培养15 d。

1.2.1.2 初步筛选

把富集培养液进行梯度稀释，并涂布于无机盐培养基平板，挑取10株单菌落划线纯化，并接入无机盐液体培养基中，30℃静置培养15 d，0.2 μm滤膜过滤，取滤液进行气相色谱检测[6]。

1.2.2 正丙醇降解菌的鉴定

1.2.2.1 形态观察试验

对平板划线的单菌落进行形态观察。革兰氏染色包括初染、媒染、脱色、复染等4个步骤，具体操作步骤见文献[7]。

1.2.2.2 分子生物学鉴定

DNA提取：将筛选的降解效果最好的菌株接入保藏培养基中，30℃培养15 d，取1 mL菌液以10000 r/min离心5 min，弃上清液，收集菌体，按生工生物细菌基因组DNA抽提试剂盒(B518225)提取DNA，-20℃保藏备用。

PCR扩增：利用引物27F和1492R对细菌基因组16S rDNA进行扩增，27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。扩增体系(25μL)：10×PCR buffer2.5μL，dNTP(2.5mmol/L each)1 μL，DNA10 ng，引物 F(10 μmol/L)0.5 μL，引物R(10 μmol/L)0.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。扩增程序：94℃ 4 min;94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃60 s，共30个循环；72℃10 min，4℃终止反应。

16S rDNA序列测定：利用胶回收试剂盒进行PCR扩增产物的纯化；纯化产物的测序工作由上海生工生物有限公司完成。

系统发育树构建：将所测定的细菌16S rDNA基因序列分别与GenBank数据库进行BLASTn和RDP Classifier相似性分析，选取与实验菌株亲缘关系相对较近的标准菌株用Clustalw软件进行序列比对，采用MEGA 5软件进行系统发育分析，构建系统发育树。

1.2.3 正丙醇降解菌培养条件的正交试验

挑选正丙醇降解效果最好的1株菌MBM-7，即降解率最高，对其培养条件进行优化，以培养温度、pH值和正丙醇含量为主要参数，采用L9(33)正交设计表进行3因素3水平正交试验，接种量5.0%，静置培养3 d，条件如表1所示进行试验。

表1 试验因素与水平

降解率计算：

式中：R为降解率，%；A为空白样正丙醇浓度，%；B为试验样正丙醇浓度，%。

1.2.4 统计分析

利用软件SPSS 22对正交试验结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

将窖泥的稀释菌液涂布在正丙醇浓度分别为1 g/L、2 g/L和4 g/L的无机盐培养基平板上，均能生长出菌落。从正丙醇浓度为4 g/L无机盐培养基平板上挑取10株菌，在30℃、15 d厌氧培养，经过滤及气相色谱测定后，筛选出了降解效果最好的菌株MBM-7，其降解率为37.0%(空白组正丙醇含量为3.99 g/L，试验组正丙醇含量为2.51 g/L)。

2.2 菌株MBM-7形态观察与分子生物学鉴定

2.2.1 MBM-7形态观察结果

经观察MBM-7革兰氏染色阳性，杆状（图1A）；菌落呈白色、表面光滑湿润、中间凸起、边缘整齐（图1B），2.0～2.3 μm×2.1～2.5 μm。

图1 MBM-7菌体及菌落形态

2.2.2 分子生物学鉴定

GenBank登录号是MH256113，将菌株16S rDNA序列与GenBank上的其他16S rDNA序列进行Blast分析，做进化树(图2)比较结果显示，菌株MBM-7与Arthrobacter protophormiaestrain DSM 20168(NR_026195)相似性为99.9%，将该菌鉴定为放线菌目下的原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)。经RDP进行分类，其分类地位为：放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌目(Actinomycetales)、微球菌科(Micrococcaceae)、节细菌属(Arthrobacter)。

2.3 菌株MBM-7培养条件正交试验结果

由于培养温度，pH值等条件会影响其降解效果，因此需进一步优化其培养条件。以培养温度、正丙醇含量和pH值3因素进行3因素3水平正交试验，结果见表2。该实验极差R可知，3种因素对菌株MBM-7正丙醇降解率的影响主次因素为B＞C＞A，即正丙醇浓度＞pH值＞温度，同时，比较同一因素在不同水平下所对应正丙醇降解率的大小，从而得知本试验的最佳水平组合为A2B1C3。因此最优培养条件为：培养温度32℃、正丙醇终浓度0.1%、pH7，降解率达到91.2%。

图2 MBM-7菌株系统发育树图

根据表3中3因素对菌株MBM-7正丙醇降解率的影响进行了方差分析，3个因素的F值由大到小依次为正丙醇浓度、pH值、温度，说明正丙醇浓度对菌株降解正丙醇的影响力最大，其次是pH值，影响最小的是温度。

表2 L9(33)正丙醇降解菌MBM-7的正交试验结果与分析

表3 正交试验方差分析

3 讨论

目前关于浓香型白酒窖泥放线菌的报道还较少，刘茂柯等[8]利用PCR-DGGE研究了窖泥放线菌群落结构和多样性，表明窖泥放线菌归于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium4个属，Olsenella、Atopobium优势随窖龄延长而升高。裴乐乐等[9]利用荧光定量PCR研究了不同窖龄窖泥放线菌，发现随着窖龄的延长，放线菌数量随之增加。此外，王涛等[10]从窖泥中分离到的Streptomyces属的多株放线菌可产酯、酸、醛、酮和醇类等浓香型白酒中的重要呈香呈味物质。但是，至今还未见有关浓香型白酒节细菌属（Arthrobacter）的相关报道。

本研究从窖泥中筛选出了1株正丙醇降解菌，经形态特征、16S rDNA序列分析，鉴定菌株MBM-7为放线菌中的原玻璃蝇节杆菌（A.protophormiae），系国内首次分离到了降解正丙醇的放线菌。从窖泥中筛选分离到的正丙醇降解菌MBM-7，通过正丙醇降解条件的优化实验，MBM-7的最适降解条件为：培养温度32℃、初始正丙醇终浓度0.1%、pH 7，在该条件下，正丙醇的降解率达到91.2%。

Labana等[11-13]研究表明，A.protophormiae能够对污染的土壤进行生物修复。但是，至今还未见有关浓香型白酒节细菌属(Arthrobacter)的相关报道。因此，对分离到正丙醇降解菌MBM-7放线菌的研究可能存在较大的应用前景。放线菌是窖泥中栖息的功能微生物菌群，并且对正丙醇具有显著的降解作用，这为浓香型白酒“降杂醇油”方面的研究提供了一种新的菌株，也对放线菌在窖泥中的功能有了新的认识。