金 艳，王英哲，陈晶晶，郭 强，徐 博

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118； 2.吉林省农业科学院，吉林 长春 130118)

全世界有近三分之一的土地是盐碱地，如何减轻盐碱地对农业生产的胁迫，使废弃地得到改良和合理利用，是当前农业生产所面临和急需解决的课题[1]。紫花苜蓿(Medicagosativa)具有广泛的生态适应性、稳定的生产力[2]以及较高的营养价值[3]，在我国农牧业生产和生态经济建设中发挥着巨大作用[4]。我国苜蓿产业尚在初级阶段[5]，未来更重要的是提高苜蓿的抗盐性，从而提高其品质[6]。因此，选育耐盐紫花苜蓿品种既能提高盐碱地的利用率，扩大紫花苜蓿种植面积，增加其产量，促进畜牧业发展，又可以改良土壤，保持水土和保护生态环境[7]。

大量研究表明不同紫花苜蓿品种的耐盐性差异很大，评价不同品种的抗逆性一直是育种学家挖掘和培育抗性品种的常用手段[8]。Al-khatib等[9]和李源等[10]研究表明，紫花苜蓿在发芽期、苗期对盐比较敏感，生长后期相对不敏感，认为苗期是耐盐鉴定的最佳时期。因此，本研究选取紫花苜蓿杂交组合的苗期作为测定时期。盐胁迫能直接影响细胞的膜脂和膜蛋白，使膜脂过氧化，膜系统受损，膜脂透性增大，从而影响膜的正常生理功能。植物在逆境条件下，渗透压相关的调节物质变化明显[11]。丙二醛(MDA)等作为脂质过氧化作用的产物其含量可代表膜损伤程度的大小，可溶性蛋白和可溶性糖是很多非盐生植物的主要渗透调节剂，在植物对盐胁迫的适应调节中是增加渗透性溶质的重要组成成分[12]。利用不同品种紫花苜蓿不育系MS-GN及在吉林省地区适应性强的父本材料配置杂交组合，对不同浓度NaCl溶液处理下的14个紫花苜蓿杂交组合F1代苗期的生理指标变化进行研究，以期筛选出对盐胁迫耐受性更强的紫花苜蓿杂交组合，为耐盐性紫花苜蓿杂交种选育提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为14个不同品种紫花苜蓿的优良单株为父本，优良不育系MS-GN为母本构建的杂交组合F1代(表1)，杂交组合F1代为父本母本一对一，具有较高的稳定性，供试材料来自吉林省农业科学院。

表1 14个紫花苜蓿品种名称及种子来源Table 1 Names and seed source of 14 alfalfa varieties

1.2 试验方法

1.2.1试验处理 试验于2017年3月20日至5月末在吉林省长春市吉林农业大学动物科学技术学院草业实验室进行。挑选籽粒饱满的紫花苜蓿杂交组合种子，培养于灭菌的营养土花盆中，花盆高15 cm、口径10 cm，每盆10粒种子，每个品种16盆，做好标记后移至HPG-400HX人工气候箱培养60 d。配制不同浓度(50、100、150、200 mmol·L-1)NaCl溶液，每个品种分5组，每组3盆即为3个重复，每盆浇灌5 mL相应浓度的NaCl溶液，每3 d处理一次，共处理3次，余下的一盆作为对照，每次处理时对照加等量的蒸馏水，9 d后，测定过氧化氢酶(CAT)活性炭、丙二醛(MDA)、可溶性糖、可溶性蛋白含量。每个处理需测量指标的样叶一次性采集，不能一次性测完的剩余样品放入密封袋，置于4 ℃低温冰箱保存，3 d内完成所有指标测定。

1.2.2测定方法与指标 本研究所使用的试剂盒统一购买于南京建成生物工程研究所。称取0.15 g新鲜叶片剪碎，加入0.05 mol·L-1、pH 7.8的磷酸缓冲液1.5 mL及少量的石英砂于研钵中研磨，研磨成匀浆后移至2 mL离心管中，5 000 r·min-1、4 ℃下离心10 min，取上清液，用于指标测定。CAT活性的测定采用可见光法[13]；MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，测定532 nm下的吸光度[13]；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法，在620 nm下测定吸光度值[14]；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法。

1.3 综合评价方法

采用Fuzzy数学中隶属函数法进行综合评判[15-16]。

与耐受性正相关的参数可溶性蛋白、可溶性糖、CAT采用以下公式：

U(XIJK)=(XIJK-XMIN)/(XMAX-XMIN)。

(1)

与耐受性呈负相关的参数MDA采用以下公式:

U(XIJK)=1-(XIJK-XMIN)/(XMAX-XMIN)。

(2)

式中：U(XIJK)为第I个杂交材料第 J个浓度处理的第K项指标的隶属度，且U(XIJK)∈[0,1]；XIJK表示第I个杂交材料，第J个浓度处理的第K个指标测定值；XMAX、XMIN为所有参试种中第K项指标的最大值和最小值。

1.4 数据处理

所得数据均采用Excel 2007、SPSS 19.0统计软件对数据进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 CAT活性的变化

对照组中，1号活性相对较小，5号活性明显高于其他杂交材料(表2)；50 mmol·L-1NaCl浓度处理后，4号、5号、6号、7号、8号、9号、10号、11号，14号含量与对照组相比下降，其余材料含量均升高；100 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比2号、3号、5号、9号含量下降，其余含量增加；150 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比3号、5号、8号、9号、10号、11号降低，其余材料含量均增加；200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比2号、3号、5号、7号、8号、9号、11号、14号含量降低，其余含量均升高，1号尤为明显。

同一NaCl浓度不同杂交组合相互比较，在对照组中，5号CAT活性最高，1号CAT活性最低；50 mmol·L-1NaCl浓度处理，3号CAT活性最高，14号CAT活性最低；100 mmol·L-1NaCl浓度处理下，8号CAT活性号最高，3号CAT活性最低；150 mmol·L-1NaCl浓度处理下，13号CAT活性最高，10号CAT活性最低；200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，1号CAT活性号最高，11号CAT活性最低。

2.2 MDA含量的变化

对照组中，不同材料之间1号MDA含量最高(表3)，7号、11号含量均低于1 mmol·mg-1；在200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比1号含量有所降低但幅度不明显(P>0.05)；8号在100、150、200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比含量显著降低(P<0.05)；其余材料在不同浓度条件下与对照组相比均呈现增加趋势。

同一NaCl浓度不同杂交组合相互比较，在对照组中，1号MDA含量最高，11号MDA含量最低；50 mmol·L-1NaCl浓度处理后，3号MDA含量最高，12号MDA含量最低；100 mmol·L-1NaCl浓度处理下，13号MDA含量号最高，8号MDA含量最低；150 mmol·L-1NaCl浓度处理下，4号MDA含量号最高，9号MDA含量最低；200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，4号MDA含量号最高，8号MDA含量最低。

表2 不同处理下对CAT活性的影响Table 2 Effect of different treatments on CAT activity U·g-1

杂交组合序号1-14同表1；同行不同小写字母表示同一杂交组合不同NaCl浓度间差异显著(P<0.05)；同列不同大写字母表示相同NaCl浓度不同杂交组合差异显著(P<0.05)。下同。

Cross combination numbers 1-14 are same to Table 1； Different lowercase letters within the same row indicate significant difference among different NaCl concentrations. Different capital letters within the same column indicate significant difference among different hybrid combinations at the 0.05 level; similarly for the following tables.

表3 不同处理下对MDA含量的影响Table 3 Effect of different treatments on MDA content mmol·g-1

2.3 可溶性糖含量的变化

对照组中，杂交组合5号、7号含量较低，12号含量最高(表4)；50 mmol·L-1NaCl浓度处理下，4号、9号、12号、13号、14号含量与对照组相比降低，7号变化不明显，其余含量均增加；100 mmol·L-1NaCl浓度处理下，1号、3号、9号、10号、12号、13号含量与对照组相比降低，7号、8号、11号含量增加但增幅不明显(P>0.05)，其余含量均显著升高(P<0.05)；150 mmol·L-1NaCl浓度处理下，8号、9号、10号、13号含量与对照组相比降低，1号、2号、3号、4号、11号、12号、14号含量增加但增幅不明显，其余含量均显著增加，6号尤其明显；200 mmol·L-1NaCl浓度处理下,8号、13号、14号含量与对照组相比显著降低，1号、2号、3号、6号、9号、12号含量升高但幅度不明显，其余含量均显著增加。

同一NaCl浓度不同杂交组合相互比较，在对照组中，12号可溶性糖含量最高，7号可溶性糖含量最低；50 mmol·L-1NaCl浓度处理后，6号可溶性糖含量最高，9号可溶性糖含量最低；100 mmol·L-1NaCl浓度处理下，4号可溶性糖含量最高，9号可溶性糖含量最低；150 mmol·L-1NaCl浓度处理下，6号可溶性糖含量最高，9号可溶性糖含量最低；200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，4号可溶性糖含量最高，8号可溶性糖含量最低。

表4 不同处理下对可溶性糖含量的影响Table 4 Effect of different treatments on soluble sugar content mg·g-1

2.4 可溶性蛋白含量的变化

对照组中，杂交组合12号含量最高，9号含量最低，两者差异显著(表5)；50 mmol·L-1NaCl浓度处理后，与对照组相比3号、4号、8号、12号、13号含量显著下降(P<0.05)，其余含量均显著增加；100 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比1号、12号、13号含量显著降低，其余含量均增加且增幅明显；150 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比2号、4号、7号、10、11号、12号含量降低，其余含量均增加；200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，与对照组相比1号、2号、7号、12号、13号含量降低，其余含量均升高。

同一NaCl浓度不同杂交组合相互比较，在对照组中，12号可溶性蛋白含量最高，11号可溶性蛋白含量最低；50 mmol·L-1NaCl浓度处理后，2号可溶性蛋白含量最高，3号可溶性蛋白含量最低；100 mmol·L-1NaCl浓度处理下，3号可溶性蛋白含量最高，12号可溶性蛋白含量最低；150 mmol·L-1NaCl浓度处理下，1号可溶性蛋白含量最高，10号可溶性蛋白含量最低；200 mmol·L-1NaCl浓度处理下，9号可溶性蛋白含量最高，12号可溶性蛋白含量最低。

2.5 综合评价

紫花苜蓿对氯化钠的耐受性与多个指标相关，通过隶属函数法求得每个杂交组合在不同浓度NaCl溶液处理下的CAT活性、MDA含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量的隶属函数值，并求其平均值，做综合评价(表6)。其中3号、2号、12号、4号、9号这5个杂交组合的加权平均值均大于0.5，耐盐性较强。各杂交组合的耐受性排序为组合3×M>组合2×M>组合12×M>组合4×M>组合9×M>组合5×M>组合7×M>组合6×M>组合14×M>组合13×M>组合8×M>组合11×M>组合10×M>组合1×M。

表5 不同处理下对可溶性蛋白含量的影响Table 5 Effect of different treatments on soluble protein content mg·g-1

表6 隶属函数值Table 6 Subordinate function values

3 讨论

3.1 利用不育系杂交评选的优势

国内外大量的作物育种实践证实，利用植物雄性不育系杂交制种可以降低生产成本，充分发挥品种的增产潜力，是获得高产优质作物新品种和高纯度种子的有效途径[17-18]。前人的研究[19]结果表明，通过利用紫花苜蓿雄性不育系配置杂交组合，对F1代的杂种优势进行了评价分析。相关结果也显示，即使从对杂交组合后代的农艺学和品质性状评价的结果来看，不同亲本得到的杂交组合后代的性状存在性状分离的现象[20]。而本研究在杂交组合F1代通过受到盐胁迫后各生理响应的评价结果，以及其综合评价赋值的结果来看，在其耐盐性方面，同一母本不同父本材料的杂交F1代耐盐性差异显著，与前人的研究结果相符。但这仅是在杂交后代中进行评价，为培育耐盐性强且农艺学性状优异的紫花苜蓿杂交种，应进一步在其父本选择上引入耐盐性综合评价，并适当进行自交性状纯合后再配置杂交组合。

3.2 杂交组合F1代的MDA等指标对盐胁迫的生理响应

植物苗期对盐胁迫更为敏感，因此苗期的耐盐性能够代表植物的耐盐程度[21]。耐盐性受遗传基础和环境因素的制约，常因其生理过程的复杂性、环境因子的多变性和两者互作的综合性而异，因此，不同种甚至是同一种不同生态型植物之间耐盐性也存在很大的差异[22]。MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，其含量的高低和细胞质膜透性的变化是反映细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标[23]。本研究中，除1号、8号杂交组合的MDA含量呈降低趋势外，其余杂交组合MDA含量均升高(表3)，说明杂交组合幼苗体内MDA的积累，降低了质膜过氧化水平，从而表现出一定的抗逆性。CAT能将H2O2转化为水和氧气，是能防止细胞受伤害的最有效的抗氧化酶[24]。本研究中，经过不同浓度NaCl溶液处理后，1号、4号、6号、10号、12号、13号CAT活性整体呈上升趋势(表2)。说明这些杂交组合在经过NaCl处理后通过积累CAT，加速清除体内的活性氧，以提高自身的抗逆性。可溶性糖的含量与渗透胁迫具有很强的相关[25]，可溶性糖能维持细胞膜结构的完整性[26]。1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、11号在NaCl处理后可溶性糖含量较对照组有所升高(表4)，表明当杂交组合幼苗受到不良环境的胁迫时会增加体内的可溶性糖含量。3号、5号、6号、8号、9号、10号、11号、14号杂交组合受不同浓度NaCl处理后，可溶性蛋白含量较对照组增幅明显(表5)，说明可溶性蛋白高含量有利于植物细胞维持较低的渗透势，增强其渗透调节能力，从而缓解因盐离子大量进入细胞和植株失水带来的伤害及次生伤害[11]。以上4种测定的生理指标都可作为反映紫花苜蓿杂交组合对盐耐受性的重要指标。本研究中，根据对测定指标的分析，可看出各杂交组合对盐胁迫的响应存在一定差异。本研究对供试紫花苜蓿杂交组合耐盐性采用NaCl进行单盐处理,缺点是离子组成与大田试验情况相差较大，鉴定结果有待进一步研究。

4 结论

单一指标隶属函数值的大小并不能代表杂交组合最终的耐盐性，因此运用综合评价方法能有效反映出杂交组合的耐盐性[27]。本研究采用隶属函数法对14个紫花苜蓿杂交组合的耐盐性进行综合评价，并选择各指标的相对值进行分析，消除了材料间固有差异，可以较准确比较其耐盐性。通过计算各项参数的隶属函数值，综合评价14个杂交组合，并对其进行排序，结果为组合3×M>组合2×M>组合12×M>组合4×M>组合9×M>组合5×M>组合7×M>组合6×M>组合14×M>组合13×M>组合8×M>组合11×M>组合10×M>组合1×M。对应材料来源可知，骑士-2(2010)、WL319HQ、维多利亚(Victorian)、阿迪娜(Adrenalin)等品种与MS-GN杂交后F1代对盐具有较高的耐受性。