, 楠, ， , , , 锦莲, 武梅*

(佳木斯大学a.附属第一医院;b药学院，黑龙江 佳木斯154002)

0 引 言

细胞电化学是基于电化学原理结合细胞学和分子生物学研究细胞荷电粒子能量传递的运动规律，进而揭示细胞结构-功能关系和外源分子对细胞功能影响的一个新的研究领域。细胞电化学在细胞水平上深入认识生命体系的运动规律，并为揭示生命过程提供科学依据和研究方法，为疾病的诊治，抗癌，抗衰老药物的设计，药物副作用的控制，食品、医疗、发酵、环保等微生物检测或监控，农作物的生长，动物的快速繁殖提供科学实验依据[1]。

葡萄糖是生物体内重要的能量来源，其水平过低会引起细胞损伤，细胞损伤可导致多种物质合成及分解代谢异常，目前常用的细胞活性检测方法有很多种，如MTT法、流式细胞仪法、ATP含量测定法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法等。电化学具有简单、快速、灵敏和价廉等优点，近年来在细胞分析领域受到了广泛的关注。本研究采用电化学方法，以鼠嗜铬细胞瘤(PC12细胞)为模型，研究低糖对PC12细胞的影响。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

电化学分析仪CHI660D(上海辰华仪器有限公司)；PC12 细胞购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；优级胎牛血清、DMEM 培养基和双抗购于 Gibco 公司；多壁碳纳米管(MWNTs)购于深圳纳米港有限公司；离子液体(bmim-PF6)购于百灵威科技有限公司。所用水均为三次蒸馏水，所有试剂均为分析纯。

1.2 PC12 细胞的培养、收集及处理

基础培养基：在细胞间内，将8.4 g的1640培养基粉末(无糖)，2g的NaHCO3放在1L的无菌烧杯中，加入适量的无菌三蒸水，使其完全溶解后，转移到1L的无菌容量瓶中，继续加无菌三蒸水定容，充分混匀，用1 mol/L的HCl和NaOH调节pH值至7.2～7.4，0.22 μm滤膜在细胞间超净台中进行过滤、分装、蜡封，4℃冰箱中保存。

无糖完全培养基：向基础培养基中加入胎牛血清、特级马血清、谷氨酰胺(4 mmol/L)、非必需氨基酸(10 mmol/L, 100×)、青霉素和链霉素(100×)，使其体积比分别为10%、5%、1%、1% 和1%，充分混合后，0.22 μm滤膜过滤，蜡封，4℃冰箱中保存。完全培养基一般情况一次配制100 mL放置于培养瓶中，每次使用前，先将其恢复至室温。

0.2mg/ml葡萄糖完全培养基、4.5mg/mL葡萄糖完全培养基、：在上述配制无糖培养基的基础上，在电子天平上分别准确称取200mg、0.45g葡萄糖完全溶解于无糖完全培养基得到相应培养基。

PC12 细胞加适量的 DMEM 培养液，置于 37℃、5% CO2、100% 饱和湿度的培养箱中培养。将生长状态良好的贴壁高分化 PC12 细胞取出，除去培养基，用 pH 7.4 的 PBS 缓冲溶液冲洗 3次，然后加入适量 pH 7.4 的 PBS 缓冲溶液，50℃浴裂解30 min，获得细胞裂解液，将其用于电化学和高效液相检测。

1.3 电化学检测

电化学检测采用线性扫描伏安法在25 ℃下进行；采用三电极检测系统进行标准品和样品的检测，以Pt丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，多壁碳纳米管-离子液体复合修饰的玻碳电极(MWCNT-IL/GCE)为工作电极，制成三电极微反应池系统。对细胞原位裂解后进行电化学检测，检测条件：扫速为 100mv·s-1，扫描电位为 0 ～ 1．1V，富集时间为 360s。

2 结果与讨论

2.1 PC 12 细胞的电化学行为研究

对PC 12 细胞的电化学行为进行研究，探寻 PC12细胞的电化学信号归属。对 PC12细胞、四种嘌呤和尿酸标准品混合液进行定性检测、匹配比对，图1为PBS和五种标准品混合物及其PC12细胞裂解液的线性扫描伏安图。a线是修饰电极在PBS溶液中的线性扫描伏安曲线，为一平滑曲线，未见任何峰电位；b线是五种混合标准品PBS溶液的线性扫描伏安曲线，在0.69 V处为黄嘌呤和鸟嘌呤的混合电化学信号，在1.0 V处为腺嘌呤和次黄嘌呤的混合电化学信号。c线为 PC12细胞裂解液的的线性扫描伏安曲线，可见在0.28 V处尿酸峰与单线尿酸峰位重合，在0.69 V处为黄嘌呤和鸟嘌呤的混合电化学信号，在1.0 V处为腺嘌呤和次黄嘌呤的混合电化学信号不明显；根据本课题组已有研究提示，尿酸峰因为细胞状态及细胞数量的多少峰电位值相差较大，不予以此信号为检测点，次黄嘌呤和腺嘌呤因为拖尾现象较严重，峰位值不稳定，不予应用，黄嘌呤和鸟嘌呤信号经反复证明是稳定可靠的，故实验以黄嘌呤和鸟嘌呤混合电化学信号峰为实验依据。

图1 修饰电极对PBS、五种标准品混合物及PC12细胞裂解液的线性扫描伏安图

a：PBS(电化学)(PH=7.4) b：五种标准品混合液(浓度：5×10-6mmol/L) c: PC12细胞裂解液(浓度：2×106 cells/mL)

图2 PC12细胞裂解液及其五种混合标准品的高效液相色谱图

2.2 高效液相色谱法检测五种标准品混合液及PC12细胞裂解液

图2为证实PC12细胞是否含四种嘌呤和尿酸，首先对PC12细胞进行纯五种标准品验证，依次加入五种标准品，归属每一标准品的保留时间，然后使用传统高效液相色谱检测证明PC12细胞电化学的可靠性，PC12 细胞样品在检测前去除大分子蛋白质等，取20 μL进行检测，由实验结果可示PC12细胞裂解液的色谱图显示5个色谱峰，与五种标准品色谱峰重合，a线为五种标准品混合液色谱图，b线为PC12细胞裂解液色谱图，五种标准品及细胞质内四种嘌呤和尿酸的保留时间为：10.9 min处为尿酸、12.8 min处为次黄嘌呤、14.3 min处为鸟嘌呤、16.0 min处为黄嘌呤和26.3 min处为腺嘌呤。

2.3 不同葡萄糖浓度作用于PC12细胞的生长曲线

为了确定葡萄糖浓度对 PC12细胞活性的影响，将PC12细胞分为4.5mg/mL葡萄糖阳性对照组、无糖阴性对照组、0.2mg/mL低糖组三组，首先建立细胞生长曲线持续跟踪细胞生长状况及观察细胞状态，并将不同葡萄糖浓度的生长曲线进行曲线拟合(图3)。结果显示4.5mg/mL阳性对照组自第三天开始，细胞生长速度较快，平台期不明显，但培养至7d时细胞生长较之前缓慢；无糖阴性对照组在前4d生长较为缓慢，自第六天开始，呈对数生长趋势，且与4.5mg/mL阳性对照组相比细胞数较少；0.2mg/mL低糖组与无糖阴性对照组生长趋势一致，但细胞数量较无糖组高，提示过低葡萄糖浓度对细胞损害较大。

图3 不同葡萄糖浓度作用于PC12细胞的生长曲线

2.4 原位电化学法检测不同葡萄糖浓度作用于PC12细胞的电化学行为

利用原位裂解定体积检测各组PC12细胞，由于原位裂解代表整体细胞活性，不仅包含每个细胞的电化学活性，而且还与各组细胞的细胞数量有关，故综合因素后环境骤变引起的波动现象不明显，实验检测结果如下(图4)：各组电化学细胞活性曲线均呈S型，逐渐上升达到细胞接触后PC12细胞活性开始下降。可见4.5mg/mL阳性对照组电化学信号明显高于其他组细胞，0.2mg/mL葡萄糖组细胞活性次之，无糖阴性对照组电化学信号最弱，提示低葡萄糖浓度均损害整体的PC12细胞活性。

图4 原位电化学法检测不同葡萄糖浓度作用于PC12细胞的电化学行为变化

a：4.5mg/mL葡萄糖阳性对照组 b: 无糖阴性对照组 c: 0.2mg/mL低葡萄糖组

3 结 论

以PC12细胞模拟神经细胞为模型，探讨神经元细胞在不同葡萄糖浓度环境生长状态，本次实验结果发现PC12细胞在无糖和低糖环境持续培养中，低糖、无糖不止细胞数量较阳性对照组少，且细胞活性和嘌呤核苷酸的代谢较阳性对照组明显减弱，进一步证明了过低葡萄糖浓度均对神经元细胞活性的损害。上述实验结果提示在糖尿病患者中，应密切监测患者血糖值，保持血糖值的稳定性，避免因血糖过低导致大脑神经元的损害，特别是罹患急性脑梗死的糖尿病患者，避免缺血再灌注损伤过程中血糖急剧的波动加重大脑神经元的损伤。