魏 亮 邹 玲 吴翠云 白红进*

(1 塔里木大学生命科学学院/新疆兵团南疆化工资源利用工程实验室，新疆 阿拉尔 843300)(2 塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

现有研究表明，枣叶中有丰富的黄酮类[1]、多酚[2]、维生素[3]、金属元素[4]、三萜类[5]、糖类、皂苷[6]等营养成分和活性成分，具有抗菌、抗氧化[7]、抗癌等生物活性，《中药大辞典》称其为“棘叶”，主治胫臁疮，具麻醉作用[8]，也可做成枣叶茶[9]等茶饮。研究表明酸枣叶提取物有明显的镇静、安神作用[10]。另外，民间也有用枣叶作为牲畜饲料，可绝大多数枣叶都没有被采收，大都自然脱落后被用来焚烧肥田，对环境造成很大污染。枣叶具有很高的药用价值和经济价值，但目前检索到有关枣叶的文献都是有关其次生代谢产物如黄酮、多酚等含量的测定[11]，或者提取工艺的优化[12]，对枣叶资源的开发利用报道很少，本研究采用高效液相色谱法建立29个品种枣叶的指纹图谱，并且做了相似度评价和聚类分析，为不同品种枣叶成分含量之间的差异鉴别及质量优劣的评价提供参考。

1 材料与仪器

1.1 试验材料与试剂

29个不同品种的枣叶均采集于新疆阿拉尔市(东经81°17′41. 61″，北纬40°32′23. 50″)塔里木大学园艺试验站红枣资源圃内多年生的枣树叶片(见表1)，经植物科学学院吴翠云教授鉴定为鼠李科枣属植物叶片。采集时间为2016年6月，采集的样品经50℃干燥恒重后粉碎，过40目筛，密封，室温储藏备用(已留样保存)。

表1 枣叶来源信息

1.2 仪器与设备

BS124S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ2200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Agilent Technologies 1260分析型液相(美国安捷伦公司)；甲醇为分析纯；乙腈为色谱纯(美国Sigma公司)；娃哈哈纯净水。

2 试验方法

2.1 对照品溶液制备

精密称取芦丁对照品适量，置于2 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1. 0 mg/mL的对照品溶液。0. 45 μm微孔滤膜滤过，4 ℃保存备用。

精确称取芦丁、野黄芩苷、橙皮苷、柚皮苷对照品，分别配制成 1. 0 mg/mL 的对照品溶液，用0. 45 μm微孔滤膜滤过，4 ℃保存备用。分别取配制的对照品溶液适量混匀，制成混合对照品溶液。

2.2 供试样品溶液制备

精密称取1. 0 g样品置于三角瓶中，按照1∶30料液比加入70%的甲醇-水溶液[13]，在室温下超声提取20 min，离心，收集上清液，每个样品取1 mL提取液过0. 45 μm的微孔滤膜，用来进行HPLC分析。

2.3 色谱条件

色谱柱为Ufavour HPLC Columns C18(4. 6 mm i. d. ×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0. 1%甲酸水(B)溶液为流动相；梯度洗脱程序：0～10 min：5%～20%(A)，10～20 min：20%～20%(A)，20～30 min：20%～50%(A)，30～35 min：50%～100%(A)，35～45 min：100%～100%(A)；检测波长280 nm；流速1. 0 mL/min，柱温25 ℃；经0. 45 μm微孔滤膜过滤后，进样10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察

取S1样品，按2.3色谱条件重复进样5次，考察仪器精密度。

2.4.2 重复性考察

取S1样品5份，按照2.2制备供试样品溶液，按2.3条件进样，考察方法的重复性。

2.4.3 稳定性试验

取S1供试样品溶液，按2.3条件，分别在0、2、4、8、24 h进样，考察样品及仪器的稳定性。

3 结果与分析

3.1 指纹图谱方法学考察结果

3.1.1 精密度试验结果

样品连续进样5次，测定的主要色谱峰的相对保留时间和峰面积无明显变化，色谱峰的相对保留时间的RSD值在0. 04%～4. 5%之间，色谱峰峰面积的RSD值低于0. 28%，表明仪器的精密度良好。

3.1.2 重复性试验结果

5份样品测定的主要色谱峰的相对保留时间和峰面积无明显变化，色谱峰的相对保留时间的RSD值在0. 11%～0. 28%之间，色谱峰峰面积的RSD值在0. 04%～2. 1%之间，表明仪器的重复性好。

3.1.3 稳定性试验结果

结果显示测定的主要色谱峰的相对保留时间和峰面积无明显变化，色谱峰的相对保留时间的RSD值在0. 16%～0. 34%之间，色谱峰峰面积的RSD值在0. 19%～0. 54%之间，表明仪器的稳定性良好。

3.2 指纹图谱的建立及相似度分析

3.2.1 混合对照品色谱图(见图1)及枣叶样品的色谱图图谱(见图2)

图1 混合对照品色图谱

图2 枣叶样品色谱图

3.2.2 29个品种枣叶指纹图谱的建立及相似度分析

将29 个品种的的枣叶制备成供试品溶液，按照2.3色谱条件进样，将各个样品测试所得的HPLC色谱图的数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行分析评价，结果见图3，表2、3、4、5、6。

图3 29个样品HPLC指纹图谱

如图3所示，对29个样品进行指纹图谱分析，标定了14个共有峰，分别是是1号(6. 51 min)、2号(9. 56 min)、3号(10. 33 min)、4号(10. 72 min)、5号(12. 36 min)、6号(12. 91 min)、7号(14. 39 min)、8号(18. 16 min)、9号(25. 36 min)、10号(25. 89 min)、11号(26. 25 min)、12号(26. 45 min)、13号(28. 19 min)、14号(28. 35 min)。峰面积较高的主要是1号、5号、8号和9号峰。

表2 29个样品共有峰相对面积(1)

表3 29个样品共有峰相对面积(2)

续上表

样品峰号1234567891011121314S260. 1380. 0290. 0520. 1340. 3020. 0170. 0631. 0000. 5850. 1110. 0710. 0910. 0520. 048S270. 1150. 0300. 0440. 0190. 2550. 0170. 0271. 0000. 6150. 1000. 0640. 0390. 0250. 068S280. 1630. 0280. 0660. 0440. 3910. 0270. 0141. 0001. 2700. 1980. 0400. 1270. 0890. 163S290. 1270. 0190. 0360. 0210. 3980. 0120. 0611. 0001. 2360. 1980. 1180. 0470. 0510. 013

表4 29个样品共有峰相对保留时间(1)

表5 29个样品共有峰相对保留时间(2)

表6 29个样品相似度评价

由表2～6可以看出，29个样品个共有峰的相对保留时间漂移不大。由表3可见，不同品种枣叶的指纹图谱相似度存在差异。根据与S30(对照图谱[14])相似度的大小，可将样品分为三类：Ⅰ类相似度为85%～91%，Ⅱ类相似度为92%～95%，Ⅲ类相似度大于95%；S1、S11、S17、S18、S24枣叶指纹图谱相似度为85%～91%，为Ⅰ类； S12、S20、S23、S28、S29枣叶的指纹图谱相似度为92%～95%，为Ⅱ类；其余的为Ⅲ类。相似度可以体现不同批次样品间各成分在种类及其相对量上的整体相似程度。分析结果表明，29个品种枣叶样品的成分和含量相似度较高，但仍然存在一定差异。

3.3 聚类分析

以 14 个共有峰的相对峰面积作为变量，运用SPSS19.0 数据处理软件对29批样品进行系统聚类分析，聚类方法为组间连接法，利用欧式距离作为样品的测度，得到样品的聚类分析树状图，见图4。根据树状图结果，与上文相似度结果相比较，可将29批枣叶大致分为三类，样品S1、S11、S17、S18、S24聚为一类，样品S12、S20、S23、S28、S29聚为一类，其余的样品聚为一类。说明同一产地不同品种枣叶的成分相似度较高，但存在一定差异，因为采摘的样品是同一个批次，可考虑是否为品种之间的差异，其原因有待进一步研究。聚类分析的意义是将不同品种的枣叶进行类别的划分，使得同一类中的元素之间相似性比其他类的元素相似性更强，可用于枣叶品质的综合评价，为枣叶资源的开发利用提供参考。

图4 29个样品聚类分析树状图

4 讨论

本试验通过对精密度、稳定系、重复性进行方法学考察，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5%，这一结果表明该方法符合建立中药指纹图谱的技术要求。利用高效液相色谱建立了29个品种的枣叶的物质指纹图谱，标定了14个共有峰，使用中药指纹图谱软件进行分析，结果表明不同样品之间相似度存在差异，根据相似度的大小，可以将不同品种的枣叶的质量分为三个等级。对29个品种枣叶的成分含量进行聚类分析，可将29 批枣叶分为三类，结果与相似度结果一致，说明本文所建立的指纹图谱具有较好的稳定性与重复性，可以用于枣叶的质量控制，为枣叶资源的综合利用提供参考。