闫 鹏,郝少飞,崔京福,刘金辉,马玉斐,关春雷,杨小玉,王潇然

(1.郑州市第一人民医院 脊柱外科,河南 郑州450004;2.吉林大学第二医院 骨科,吉林 长春130041;3.吉林省人民医院 泌尿外科,吉林 长春130021)

脊髓损伤(spinal cord injury; SCI)在我国较为常见，是可以引起极高致残率的伤病之一，由其导致的膀胱支配神经损害均可引起神经原性膀胱排尿功能障碍。常表现为膀胱感觉及运动功能障碍，进而可引起严重的尿潴留、尿路感染、最终导致肾功能衰竭，成为目前脊髓损伤病人主要的死亡原因之一[1,2]。因此能否重建SCI后病人的膀胱功能，对于提高截瘫患者的生活质量，延长此类患者的生存期及降低死亡率具有十分显著的意义。

本课题组前期研究表明[3,4]：长期阳极阻断电刺激骶神经前根(300 us脉宽、1.05 mA刺激电流)可以减少膀胱残余尿量，提高排尿效率，增加膀胱体积，降低膀胱最大逼尿肌压、静息压及逼尿肌漏点压，重建膀胱顺应性，缓解逼尿肌活动亢进及外括约肌病理性活动，进而可以有效的保护上尿路，从而改善膀胱-输尿管返流等并发症，最终达到重建SCI后膀胱的排尿功能目的。本实验通过透射电镜观察逼尿肌超微结构变化，探讨其对膀胱逼尿肌超微结构的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组

清洁级成年健康新西兰白兔24只，质量2.0-2.5 kg，雌性，由吉林大学医学部动物实验室提供，动物许可证：SCXK-(吉)2008-0005，集中饲养两周后进行实验。实验过程中对动物的处理原则及方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[5],采用随机抽样方法将实验动物分为三组，A组为假手术对照组(n=8)，B组为脊髓损伤组(n=8),C组为电刺激组(n=8)。

1.2实验仪器及设备

EM-1200EX型投射电子显微镜(日本)，OLYMPUS BX51电子显微镜(日本)，LKB-III型超薄切片机(瑞典)，多通道电生理仪( BL420 - E生物机能试验系统，成都泰盟科技有限公司)，实验所用骶神经根电刺激器和刺激电极均由吉林大学提供，实验所用速眠新 Ⅱ 、苏醒灵4号由吉林大学农学部提供。

1.3试验方法

1.3.1动物模型的制备

对照组实验兔通过假手术处理：仅切除椎板并缝合切口。脊髓损伤及电刺激组实验兔均采用脊髓夹闭法致脊髓损伤[6]，术后所有实验兔均单独安置于兔笼中饲养，每天3次按压腹部帮助其排二便，垫料每日更换；实验过程中所用青霉素按每公斤体重10万单位肌注给药，连续用5天；手术切口每日1次消毒换药。术后完全性SCI兔皮肤于损伤平面以下对疼痛刺激无反应,表现拒食，双后肢及尾部均不能自主活动，所有实验兔均存活。饲养10天后，SCI组及电刺激组经尿动力学检测为神经源性膀胱，电刺激组实验兔以骶1-骶4棘突为中心，依次切开皮肤及皮下组织并暴露椎板，咬除椎板后依次显露骶神经前、后根。通过显微外科技术分离并切断双侧骶1-骶4骶神经后根完成去传入，然后将实验兔缓慢侧身，改为侧卧位，从而可以最大限度的减少电刺激传入时腹压的增加对膀胱内压形成的干扰。采用自制银钩状电极通电刺激实验兔骶神经前根，依据电刺激时导致的膀胱内压的升高变化来判断其支配膀胱逼尿肌的优势神经根(主要为骶2和骶3神经根),然后在双侧支配逼尿肌的优势神经根处各放置一枚刺激电极，轻轻缩紧镍环，缝合并固定刺激电极。通过术后第2天对实验兔摄腰椎正侧位X线片来确定刺激电极位置是否良好。

电刺激组实验兔植入刺激电极完成后第二天开始每日进行6次阳极阻滞电刺激促进排尿、排便，刺激参数为刺激脉宽300 us，刺激电流达到1.05 mA[7]，每次15-30 min，电刺激组兔电刺激时间累计达到120 h后取材。

1.3.2取材

所有的实验图实验过程中均使用速眠新进行静脉麻醉，取准备取材实验兔进行备皮、消毒，术者带一次性无菌手套，取耻骨上下腹正中切口，依次切开皮肤及皮下组织，游离腹膜及肠管后进入盆腔，显露膀胱后采用组织剪沿膀胱颈部横行间断，截取少量逼尿肌组织放置于预冷的戊二醛溶液中固定以备行透射电镜观察。

1.3.3透射电子显微镜检查

样品制作过程详见文献[4]，观测指标：

逼尿肌细胞形态、大小、排列及边界是否规则，染色质是否均匀，细胞核形态及染色深度。细胞间间距、连接方式及数量是否存在变化，细胞膜表面是否规整光滑，胞内肌质膜下胞饮小泡数量是否变化，胞浆内肌丝数量有无增减，排列有无变化。胞内各种细胞器如线粒体、内质网、溶酶体等结构是否变化，胞脊排列规则程度，粗面内质网等形态学表现,致密体分布是否均匀，核周间隙有无空间改变及空泡是否形成，细胞间隙有无缩窄，有无胶原纤维和无定形成分等。

2 结果

2.1大体组织标本观察脊髓损伤(SCI)组膀胱可见大体标本体积减小，颜色偏向暗黄，组织表面血管网明显减少，膀胱壁与周围组织粘连较重，膀胱内尿液混浊且粘稠，偶可见肉眼血尿，切片取材时切面可见部分纤维化及坏死；对照组与电刺激组实验兔膀胱体积与脊髓损伤组相比明显增大，颜色粉红，表面可见大量血管组成的血管网，膀胱壁与周围组织界限清晰，膀胱内尿液较清亮，取材切面未见明显异常。

2.2超微结构对照组膀胱逼尿肌细胞呈梭形，细胞饱满且排列整齐有序，走向均匀；细胞间距较小且致密，细胞间充斥着大量的中间连接，偶可见胶原及弹性纤维，细胞基质内可见线粒体、高尔基体、内质网及溶酶体等细胞器且胞内未见空泡状改变。细胞核呈椭圆形或球形，核膜下可见异染色质，核仁大而清晰(图1)；脊髓损伤组表现为逼尿肌细胞外形不规则，大小不一且排列混乱无序，细胞间距增宽且细胞间可见大量的胶原纤维，胞突连接、桥粒连接及缝隙连接明显增多，细胞内细胞器增多且大多呈肿胀、空泡化及脱颗粒状改变，肌细胞内肌丝明显减少且走行排序紊乱，细胞膜周围可见高电子密度物质堆积，凋亡细胞增多，细胞内染色质浓缩，核膜表面凹凸不平，出现核固缩和核溶解(图2)；与上述脊髓损伤组细胞的超微结构相比，电刺激组肌细胞形状较为规则，大小相对均匀，凋亡细胞明显减少，染色质着色较浅，核固缩及核溶解消失，细胞基质内细胞器肿胀缓解，肌细胞间间隙减小，仅见少量的胶原纤维，中间连接较多而胞突连接及缝隙连接较少(图3)。

图1对照组图2脊髓损伤组图3电刺激组

3 讨论

临床疾病中由于各种原因如脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)、周围神经病变等导致的膀胱支配神经受损均可产生神经原性膀胱进而引起排尿功能障碍。部分患者常表现为残余尿量增加,严重者则在出现肾功能损害后才进行治疗,此时膀胱逼尿肌已经发生较为严重的损害,功能已产生严重下降，给后续的治疗带来很大的困难，脊髓圆锥以上层面损伤时,膀胱的脊髓反射弧结构完整，在脊髓休克缓解后，多进展成高张力、高反射的痉挛性膀胱，临床上常表现为神经原性逼尿肌病理性活动和逼尿肌和括约肌协同运动失调,病人贮尿与排尿功能双重障碍，而这种长期膀胱功能紊乱会致膀胱逼尿肌结构发生病理性改变，本课题组前期研究结果表明，应用阳极阻滞电刺激骶神经根可以可以完全重建膀胱排尿功能(300 us脉宽、1.05 mA刺激电流)[3]，本研究旨在通过透射电镜观察逼尿肌超微结构变化，探讨其对膀胱逼尿肌超微结构的保护作用。

膀胱逼尿肌功能上属于平滑肌，其收缩功能与其正常的组织结构、肌细胞内钙离子水平和线粒体的功能等密切相关，正常逼尿肌组织镜下由以下三种显微结构组成:平滑肌细胞、细胞间质和壁内神经。上述任一种结构发生改变即可影响逼尿肌的功能，并可根据膀胱壁组织活检以及逼尿肌切片电镜下观察超微结构结果来判断逼尿肌功能[8-10]。

正常的平滑肌细胞形态、大小、结构基本相似,分布较为均匀,走行基本一致。细胞间可见大量的中间连接和散在的桥连接及缝隙连接， 细胞间距较小且均匀致密，致密区与胞饮小泡沿肌质膜分布均匀，细胞内可见线粒体、内质网、溶酶体等各种细胞器,肌丝数量较多，且与致密体平行排列，而脊髓损伤后除失神经支配外，膀胱逼尿肌超微结构也会出现结构上的改变：例如肌细胞体积增大、胞内细胞核体积增大,线粒体减少，核内颗粒增多,肌丝数量减少且走行紊乱，与肌丝活动有关的密区和致密体排列混乱且不规则,胞饮小泡减少，细胞间隙增宽、分布不规则且走行不均匀，细胞间可见大量锯齿状的胞突连接以及较多紧密连接，细胞间质大量胶原纤维和弹性纤维浸润，中间连接较少,正常肌束结构消失，这些改变均可导致肌细胞丧失正常的收缩功能，减弱了相互间的耦联作用,进而导致逼尿肌收缩无力或无收缩[11]。

本实验研究结果显示：电刺激组相对于脊髓损伤组平滑肌较规则，形态及细胞体积明显更接近于正常对照组，凋亡细胞减少，染色质着色较轻，核固缩消失，肌胞内细胞器肿胀缓解，细胞间间隙缩短，胶原纤维及弹性纤维减少，中间连接增多，胞突连接及缝隙连接减少，其上述改变与对照组逼尿肌超微结构基本相近，并没有发生病理改变，结果表明通过阳极阻滞电刺激骶神经根可以重新建立膀胱逼尿肌失神经支配，也解释了阳极阻滞电刺激骶神经根时膀胱内压可以接近正常组膀胱内压，排尿时逼尿肌收缩有力。

在本研究中，我们通过采用透射电镜方法，发现长期阳极阻断电刺激骶神经根具有促进神经原性膀胱逼尿肌超微结构恢复的作用，稳定膀胱内坏境，改善膀胱排尿功能，但此过程中是否有逼尿肌神经营养成分的参与,例如提供生长因子，改善细胞外内环境成分等,有待进一步的实验深入研究。