张林明 李陶乐 段尉梅 张玉林 陈玲 戴淑娟 艾青龙 徐忠

[摘要] 目的 通过对云南地区临床诊断为脊髓小脑共济失调的家系进行SCA3基因检测，探讨汉族人群遗传性脊髓小脑共济失调3型（spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）患者临床特点与遗传学特征。 方法 对4个家系26例脊髓小脑共济失调患者进行神经系统检查和家系谱调查，应用聚合酶链反应（PCR）、琼脂糖凝胶电泳和基因测序等技术进行 SCA3 基因内CAG三核苷酸重复序列，并对异常等位基因片段进行DNA测序。 结果 临床表现以共济失调和构音障碍为主，其次表现为锥体束征、眼部症状等，认知功能障碍较少见。检出4个家系（26例患者）为SCA3，符合常染色体显性遗传特点，测序证实其异常等位基因CAG重复数目在67～82次之间。 结论 云南地区汉族的SCAs患者以SCA3型为主，主要表现为共济失调和构音障碍，基因检测仍是其诊断的金标准。

[关键词] 汉族；脊髓小脑共济失调3型；体征和症状；基因型；三核苷酸重复扩增

[中图分类号] R744.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）27-0004-03

[Abstract] Objective To investigate the clinical characteristics and genetic characteristics of patients with hereditary spinocerebellar ataxia type 3（SCA3） in Han population by SCA3 gene detection in the family of clinical diagnosis of spinal cord cerebellar ataxia in Yunnan. Methods Neurological examination and family pedigree survey were performed on 26 patients with spinal cord cerebellar syndrome in 4 families. Polymerase chain reaction（PCR）， agarose gel electrophoresis and gene sequencing were used to carry out CAG trinucleotide repeats in SCA3 gene. And DNA sequencing of abnormal allelic fragments was performed. Results The clinical manifestations were mainly ataxia and dysarthria， followed by pyramidal tract signs and eye symptoms. Cognitive dysfunction was less common. 4 families（26 patients） were detected as SCA3， consistent with autosomal dominant inheritance. Sequencing confirmed that the number of abnormal allele CAG repeats was between 67 and 82 times. Conclusion SCA3 type is the main type of SCAs in Han nationality in Yunnan， mainly characterized by ataxia and dysarthria. Genetic testing is still the gold standard for diagnosis.

[Key words] Han nationality； Spinal cerebellar ataxia type 3； Signs and symptoms； Genotype； Trinucleotide repeat amplification

脊髓小脑性共济失调（spinocerebellar ataxia，SCA）是一组以共济失调为主要表现的神经系统变性疾病，伴随有眼球活动障碍、锥体束受损、周围神经病及认知功能障碍等症状[1]，以常染色体显性遗传为主，该类疾病各亚型临床表现复杂，症状间存在交叉，因此临床分型及鉴别诊断十分困难。1992年Volz首次报道了脊髓小脑性共济失调1型（SCA-1）的基因位点，从此开启了对SCAs的基因诊断和发病机制的研究，目前为止发现约40余种亚型[2]，SCA3/MJD（又称马查多-约瑟夫病，Machado-Joseph disease，MJD）是最常见的亚型[3]。1994年Kawaguchi发现该基因定位于常染色体14q32.1，该基因10号外显子区的（CAG）n异常重复扩增是该病的遗传学病因[4]。为了解云南地区SCA3/MJD患者是否具有独特的临床特点与遗传学特征，我們对4个云南地区汉族SCA家系进行检测和分析，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择昆明医科大学第一附属医院和云南省第三人民医院神经内科收集的共4个家系26例患者（男14例，女12例，平均年龄39.2±4.2岁）和7例“健康”家系成员（即无临床症状的家系成员，男4例，女3例，平均年龄33.0±5.7岁），均为汉族，所有家系均来自云南各地州。临床诊断依据Harding标准[5]。另选择同期在昆明医科大学第一附属医院和云南省第三人民医院体检中心进行体检的30例正常人（男15例，女15例，平均年龄38.2±5.1岁，汉族，无家族遗传病史，与上述家系均无血缘关系，神经系统查体无阳性体征）作为对照组。

1.2研究方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取SCAs患者、“健康”家系成员和正常对照组外周血4 mL，采取标准酚/氯仿抽提法提取DNA作为PCR模板。

1.2.2 PCR扩增 根据文献[6]合成引物：SCA3-F：5-CCAGTGACTACTTTGATT CG-3；SCA3-R：5-TGGCCTT TCACATGG ATGTGA A-3。25 μL反应体系：10×PCR Burffer 2.5 μL，20 mmol/L mg2+1.875 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq酶（5U/μL）0.2 μL，Primers（0.1 μg/μL）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR 扩增：95℃预变性5 min，94℃变性40 s；不同退火温度55℃退火40 s；72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min；4℃保存；共30个循环。PCR产物检测：使用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后在自动凝胶成像系统上观察结果。

1.2.3毛细管电泳片段分析 使用Genescan软件分析结果，CAG重复拷贝数=[DNA片段长度（bp）-侧翼区长度（bp）]/3。

1.2.4 DNA 将纯化后的PCR产物与PMD-19T载体16℃，60min连接反应；取10 μL连接产物转化克隆；取阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取质粒后利用AB1377测序仪测序，测序结果序列对比使用NCBIBlast完成。

1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，在相关性分析中，资料符合正态分布，采用Pearson相关分析，否则采用 Spearman 相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 SCA3/MJD患者的临床特点

4个家系的26例患者，男14例，女12例，发病年龄20～53（39.5±5.3）岁，病程2～19年，符合常染色体显性遗传特征。所有患者均有程度不等的共济失调和构音障碍，其次表现为锥体束征17例（65%），眼外肌麻痹13例（50%），感觉障碍12例（46%），眼球震颤9例（34%），认知功能障碍较少见有4例（15%）。

2.2 SCA3/MJD的基因诊断

SCA3/MJD基因诊断标准为CAG重复次数≥62次，检测结果显示，4个家系中有26例患者达到这一标准，可以诊断为SCA3/MJD患者，CAG重复次数为67～82（74.1±5.8）次；症状前患者7例（男4例，女3例）突变等位基因CAG重复次数为62～80（67.2±6.8），正常对照组CAG重复次数为14～46（38.4±2.1）（图1）。

2.3 SCA3/MJD临床症状与CAG重复次数的关系研究

2.3.1 发病年龄与CAG重复次数的相关性 26例SCA3/MJD患者的发病年龄与CAG重复次数有显著的负相关性，Pearson相关系数r=1.241，P<0.01，CAG重复次数越多，发病年龄越早。

2.3.2 SARA评分与CAG重复次数的相关性 26例SCA3/MJD患者的SARA评分与CAG重复次数无相关性，Pearson相关系数r=0.248，P>0.05。

3讨论

脊髓小脑性共济失调各亚型临床表现复杂，具有高度的临床变异性和遗传异质性。Tang B等[7]研究表明，SCA3/MJD是中国最普遍的类型，我们研究的4个家系均为SCA3，进一步验证了该结论。

SCA3/MJD临床表现复杂，分为4种亚型[8]：1型小脑症状不明显或较轻，可有面、舌部肌束震颤和突眼，多于45岁左右死亡；2型20～45岁发病，有明显的小脑及锥体系或椎体外系症状，病情较轻，死亡年龄约60岁；3型40～60岁发病，表现为小脑症状及远端肌肉无力，感觉减退，深反射低下或消失，病情进展较慢；4型以帕金森症状为特点。本研究中报道的病例发病年龄20～53岁，所有患者均有共济失调和构音障碍，以2、3型为主，但病例数较少，需进一步扩大样本量，以便发现SCA3/MJD的其他亚型。

目前报道的SCA3/MJD患者CAG重复次数存在一定差异：国外的报道次数61～89次不等，其中最低为45次[9]；国内不同地区存在差异：宁夏地区为66～81次[10]，广西地区为68～78次[11]，重庆地区为58～71次[9]，河南地区为70～79次[12]，国内最低为43次。本研究中云南地区汉族SCA3/MJD患者CAG的重复次数67～82次，症状前患者为62～80次，与国内研究基本一致。

SCA3/MJD具有遗传早现现象，其基础是CAG重复次数在代间的不稳定扩增的结果，下一代CAG的重复次数较上一代增多，本研究中发现云南地区汉族SCA3/MJD患者的发病年龄与CAG重复次数呈显著负相关，CAG重复次数越多，发病年龄越早，与国内外报道一致[11，13]。本研究中发现4个家系中均存在下一代较上一代发病年龄提前、病情严重的情况。

Shang-Ran Huang[14]在研究中發现CAG重复次数与患者SARA评分无统计学意义，这与本文研究一致；在研究脊髓小脑性共济失调方面，国际协作共济失调评估量表（ICARS）与SARA评分都用来评估患者共济失调的严重程度，顾卫红等[15]在其类似研究中发现，ICARS评分与CAG重复次数无关，但与患者的病程显著相关；Carlos等[16]研究发现SARA评分与灰质体积呈负相关，这些前期的研究成果提供更广泛的思路，我们将进一步收集病例，研究病程、灰质体积、SARA评分间相互关系。

本研究发现，脊髓小脑性共济失调亚型众多，临床表型复杂，通过基因检测可以做出准确的诊断，云南地区脊髓小脑性共济失调以SCA3/MJD为主，这为我们进一步研究该类型疾病的发病机制和治疗方法奠定基础。

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（收稿日期：2017-09-28）