樊英智，邬明丽，李世鹏，高 源，赖振雨，雷初朝，党瑞华

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌 712100)

细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。细胞转染的方法有很多：生物学方法(即以病毒为载体的转染方法)、化学方法(磷酸钙共沉淀法、EDTA-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法)、物理方法(显微注射法、基因枪法、电穿孔法、激光照射法、声孔效应法、磁性纳米颗粒等)。其中大部分方法对设备和操作的要求都较高，且效率不高。而电穿孔技术是利用电流来增加细胞膜的可透性，高效快速地将外源物质转入细胞中，操作简便，效率较高[1-3]。目前，新兴的CRISPR/Cas9技术具有高度适应性、组装简便性、高特异性，成为当前最常用的基因组编辑方法，通过电转可以将编辑组件导入胚胎实施精确编辑，进一步推动在实践中的应用，但此方面的研究鲜见报道。由于mRNA具有不稳定性，且电转需将构建的mRNA置于靶细胞所处的环境中，但mRNA在该环境易被分解，这给试验带来极大的不便[4]。另外，体外转录法获得mRNA成本相对较高。因此，本研究以大分子荧光染料四甲基罗丹明标记的葡聚糖(Tetramethylrhodamine-labelled dextran)、带绿色荧光蛋白标记的质粒pLL3.7、体外转录的绿色荧光蛋白mRNA作为替代基因编辑组件的外源物质，探索电穿孔法将外源物质导入小鼠胚胎的最优条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.2 方 法

1.2.1 引物设计 根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)pLL3.7质粒中eGFP(enhanced green fluorescent protein)基因的CDS区设计引物，引物序列见表1。其中，上游引物包含T7启动子序列。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。……