王平，孙铁锋，国锦，焦园园，刘瑾，赵渤年，高燕

(1.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；2.天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室， 天津 300072；3．山东中医药大学，山东 济南 250014；4.天津中医药大学，天津 301600)

痛风是由单钠尿酸盐(MSU)沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，包括急性发作性关节炎、痛风石性慢性关节炎和尿酸性尿路结石等疾病，重者可出现关节残疾和肾功能不全。痛风中高发而且危害较重的一种是急性痛风性关节炎，多因尿酸盐沉积在关节囊、滑囊、软骨、骨质和其他组织中而引起病损及炎性反应，易发于40岁以上男性，多见于第一跖趾关节，尤其是踝部与足部关节[1-2]。随着中国民众饮食结构发生变化，其发病率连年升高，严重影响着患病人群的生活质量[3-5]。痛利舒颗粒为临床经验方，由茵陈、泽泻、栀子等十几味中药组成，具有清热利湿、化瘀止痛、益气滋阴的功效，临床上能有效缓解痛风性关节炎发作期的疼痛。为验证其疗效，我们进行了痛利舒颗粒的抗急性痛风性关节炎、抗炎和镇痛实验研究。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠90只(雌性，体重18～20 g，许可证号：SCXK(鲁)20140007，质量合格证号：No：37009200007866)；SPF级KM小鼠70只(雌雄各半，体重18～20 g，许可证号：SCXK(鲁)20140007，质量合格证号：No：37009200007636)；SPF级SD大鼠70只(雄性，体重180～200 g，许可证号：SCXK(鲁)20140007，质量合格证号：37009200008127)；均由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。

1.2 药品

痛利舒颗粒(山东省中医药研究院中心实验室课题组提供，批号：20170511；成人日服3次，每次12 g。各项实验痛利舒颗粒均设3个剂量组，低剂量组相当于临床等效剂量，中、高剂量组为临床等效量的2倍和4倍)；痛风定胶囊(四川升和药业股份有限公司，批号：1611101，成人日服3次，每次1.6 g，实验所用剂量为其临床等效量的2倍)；布洛芬片(山东新华制药股份有限公司，批号：1703067，成人日服2次，每次0.4 g，实验所用剂量为其临床等效量的2倍)；吲哚美辛片(上海金不换兰考制药有限公司，批号：20160201，成人日服3次，每次25 mg，实验所用剂量为其临床等效量)；别嘌醇片(广州彼迪药业有限公司，批号：20170505，成人日服2次，每次0.53 g，实验所用剂量为其临床等效剂量)。

1.3 试剂

巴豆油(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，批号：5MXNJ-JQ)；尿酸钠盐(Sigma公司，批号：BCBS7438)；生理盐水(辰欣药业股份有限公司，批号：1708142704)；戊巴比妥钠(默克化工技术(上海)有限公司，批号：20171017)；吐温80(天津市光复精细化工研究所，批号：20150106)；大鼠血清TNF-α ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20171009)；大鼠血清IL-6 ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20171009)。

1.4 仪器

YLS-6B型热板仪(上海精密仪器仪表有限公司)；BT125D型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；ENDURA E0541型游标卡尺(力易得格林利工具(上海)有限公司)；TDL408型低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；9 mm打孔器。

2 实验方法

2.1 痛利舒颗粒对急性痛风性关节炎大鼠模型的影响

2.1.1 尿酸钠注射悬液配制

取250 mg 结晶性尿酸钠, 加入0.9%氯化钠注射溶液9 mL，再加1 mL吐温 80，加热搅拌，配制成10 mL尿酸钠混悬溶液，浓度为12.5 mg/mL。

2.1.2 1%戊巴比妥钠溶液配制

称取戊巴比妥钠2.5 g，加至250 mL生理盐水中，摇匀，即得。

2.1.3 SD大鼠急性痛风性关节炎模型的制备

采用经典Cdoerre急性痛风性关节炎大鼠造模方法[6-11]。用6号注射针在受试大鼠右侧踝关节背侧从 45°方向插入胫骨肌腱内侧，感觉有落空感后，将0.2 mL尿酸钠溶液(25 mg/mL)注入到踝关节腔，以关节囊对侧鼓起为造模标准，形成急性痛风性关节炎模型。空白对照组注入等体积的生理盐水-吐温80。

2.1.4 动物分组与给药

将造模SD大鼠按体重随机分为7组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组，痛风定胶囊组，吲哚美辛组，痛利舒高、中、低剂量组(12.96 g/kg、 6.48 g/kg、3.24 g/kg)。各组动物灌胃给予相应药物，空白对照组和模型对照组均灌胃给予等容量的生理盐水，灌胃容积10 mL/kg，连续给药 7 d。

2.1.5 指标测定

2.1.5.1 大鼠足踝关节直径测量

造模前于大鼠右后足踝关节上方 1.0 cm处用编号笔作一横线标记，并用游标卡尺测量踝关节直径。造模后第一天分别在 4 h、8 h 测量右后足踝关节直径，计算关节肿胀度。每天测1次，连续 7 d。

踝关节肿胀程度=造模后踝关节直径-造模前踝关节直径

2.1.5.2 血清IL-6、TNF-α含量的测定

大鼠末次灌胃3 h后，1%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血5 mL，静置30 min后，以3 000 r/min的转速离心10 min，分离血清，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中 TNF-α、IL-6水平。

2.2 痛利舒颗粒对热板法测定小鼠痛阈值的影响

2.2.1 实验动物筛选

KM种小鼠90只，雌性，体重20±2 g，将小鼠置于可调恒温热板仪上，温度控制在55±0.5 ℃，用秒表记录小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间(s)作为该鼠的痛阈值[12-13]。凡痛阈值小于5 s或大于30 s 或喜跳跃者弃之不用。重复测定其痛阈值2次，取两次痛阈平均值，作为该鼠给药前痛阈值。

2.2.2 动物分组与给药

选择痛阈值符合实验要求(5 s<给药前痛阈值<30 s)的合格小鼠60只，随机分为6组，每组 10 只，分别为空白对照组、布洛芬组、痛风定组、痛利舒低、中、高剂量组(4.68 g/kg、9.36 g/kg、18.72 g/kg)。各给药组分别灌胃给予相应药物，空白对照组灌胃给予等容量的生理盐水，给药容积25 mL/kg，每日灌胃 1 次，连续给药7 d。

2.2.3 指标检测

末次给药后分别于30、60、90、120 min测定痛阈值1 次，如60 s仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阈值以60 s计算。按下列公式计算痛阈提高率：

2.3 痛利舒颗粒对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀的影响

2.3.1 2%复合巴豆油的配制

取巴豆油0.5 mL，无水乙醇5 mL，蒸馏水1.25 mL，乙醚18.25 mL，混匀，即得2%复合巴豆油溶液25 mL。

2.3.2 实验分组与给药

KM小鼠 70 只，适应性喂养 3 d后按体重随机分为 6组：空白对照组、布洛芬组、痛风定胶囊组、痛利舒低、中、高剂量组(4.68 g/kg、9.36 g/kg、18.72 g/kg)。每组 10 只，各给药组分别灌胃给予相应药物，空白对照组灌胃给予等容量的生理盐水，给药容积25 mL/kg，每日给药1次，连续给药7 d。

2.3.3 指标检测

末次给药1 h后，用微量移液器将2%复方巴豆油致炎液20 μL均匀涂于每只小鼠的右耳正反两面致炎[14-15]，左耳不涂作对照，4 h 后脱颈椎处死小鼠，沿着小鼠耳廓基线剪下两耳，用直径9 mm 的打孔器分别在两耳的同一部位打下圆耳片，用电子天平称重，每鼠的右耳片重量减去左耳片重量即为肿胀程度。计算各组肿胀度之平均值与标准差，并按公式计算给药组的肿胀抑制率(%)。

耳肿胀度=右耳片质量-左耳片质量，

3 统计学分析

4 实验结果

4.1 痛利舒颗粒对急性痛风性关节炎大鼠模型踝关节肿胀程度的影响

造模前，各组大鼠精神佳，进食及饮水正常，体重增长正常，毛色白而有光泽。造模后，除空白对照组外，其余各组大鼠精神欠佳，活动减少，进食减少，饮水增多，毛色干枯发暗，体重基本无增长甚至略有减轻。造模后 2 h，除空白对照组外各组大鼠右侧踝关节均出现明显的皮肤发红，造模处皮肤发热，关节肿胀，空白对照组关节处出现略微肿胀。

由表1结果可见，造模24 h后，与空白对照组比较，模型对照组踝关节肿胀程度明显增加，差异具有显著性意义(P<0.05)，表明急性痛风性关节炎大鼠模型建立成功。造模24、48、72、144 h后，痛利舒高剂量组踝关节肿胀程度与模型对照组比较明显减轻，差异具有极显著性差异意义(P<0.01)，提示痛利舒高剂量组能明显改善SD大鼠的踝关节肿胀程度。中剂量组和低剂量组在造模24、48、72、144 h后也可以改善踝关节肿胀程度，但是部分时间点未出现显著性差异(P>0.05)，痛风定组可以改善踝关节肿胀程度，但没有显著性差异(P>0.05)；吲哚美辛片组在144 h与模型组比较具有极显著性差异(P<0.01)。以上结果表明，痛利舒颗粒能明显减轻急性痛风性关节炎大鼠模型踝关节肿胀程度，具有明显的抗炎作用。

表1 痛利舒颗粒对急性痛风性关节炎大鼠模型踝关节肿胀程度的影响

注: 与空白对照组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

4.2 痛利舒颗粒对急性痛风性关节炎大鼠模型血清IL-6、TNF-α含量的影响

由表2结果可见，与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功。与模型对照组比较，吲哚美辛组、痛风定组及痛利舒颗粒低、中、高剂量组均可以明显降低血清TNF-α、IL-6水平，说明阳性对照药组及痛利舒各剂量组均可降低尿酸钠致踝关节肿胀大鼠模型的血清中异常升高的TNF-α和IL-6水平。本实验结果表明，痛利舒颗粒对急性痛风性关节炎大鼠具有良好的抗炎作用。

表2 痛利舒颗粒对急性痛风性关节炎大鼠模型血清IL-6、TNF-α含量的影响Table 2 Effect of Tonglishu Granule on serum IL-6 and TNF-α contents in rat model of acute gouty

注: 与空白对照组比较#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01 。

4.3 痛利舒颗粒对热板法测定小鼠痛阈值的影响

由表3、表4结果可见，与空白对照组相比，布洛芬组和痛风定组给药后均表现出明显的镇痛作用(P<0.01)。痛利舒颗粒各剂量组末次给药30 min后，随着时间和剂量的增加痛阈值也增加，呈正相关，高剂量组效果最好。其中高剂量组与空白组比较，30、60、90 min时间点痛阈值具有显著性差异(P<0.05,P<0.01), 120 min时间点没有显著性差异(P>0.05)。结合小鼠痛阈值提高率可以发现，痛利舒颗粒作用缓和，时间相对持久。综上所述，痛利舒颗粒可以提高小鼠痛阈值，有很好的镇痛作用。

表3 痛利舒颗粒对热板法所致小鼠疼痛模型痛阈值的影响

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01 。

表4 痛利舒颗粒对热板法所致小鼠疼痛模型痛阈提高率的影响Table 4 Effect of Tonglishu Granule on the increase of pain threshold in mouse pain model induced by hot plate method

4.4 痛利舒颗粒对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀的影响结果

实验过程中小鼠精神状态良好，皮毛光滑，大便正常，垫料隔天更换一次，实验过程中小鼠无死亡。由表5可见，与空白对照组比较，布洛芬组、痛利舒颗粒中、高剂量组显示出明显的抗炎效果，差异具有统计学意义(P<0.01 或P<0.05)，其中阳性对照药布洛芬的抗炎效果最显著。痛风定组未出现较为明显的抗炎效果，差异不具有统计学意义(P>0.05),但耳肿胀度相比空白对照有下降趋势。

表5 痛利舒颗粒对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀的影响Table 5 Effect of Tonglishu Granule on the swelling of mouse ear caused by croton

注: 与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01 。

5 讨论

中医认为痛风属于“痹症”，气血运行不畅，浊瘀滞留关节，才会出现关节炎症和肿胀等临床表现。急性痛风性关节炎为痛风发作期的典型表现，中医认为，此病多见于青壮年男性，因多食肥甘油腻、酒肉之品，脾运虚弱，湿浊内蕴，热毒内结而发病。有研究表明，急性痛风性关节炎患者血清及组织里会产生出多种细胞促炎因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等，可促使炎症范围不断扩大，发生关节红肿、皮温增高、剧烈疼痛以及出现不同程度的关节功能障碍。其中，TNF-α和IL-6为炎症反应出现时较为关键的细胞因子。TNF-α 是由巨噬细胞在细菌感染或免疫源反应过程中分泌的小分子蛋白，作为炎性反应的重要启动因子，能促进IL-1、IL-6等炎性因子的生成，增强中性粒细胞对血管内皮的粘附性，进而形成复杂的细胞因子作用网络，放大炎性反应。IL-6 为巨噬细胞的激动剂,为经典的炎症因子调节剂，控制着炎症介质的产生和分泌, 进而加重机体的炎性反应。IL-6可促进炎症相关的 B 细胞和 Th17 细胞的分化以及急性期蛋白的合成，诱导破骨细胞分化，造成关节损伤。故本实验在对急性痛风性关节炎进行研究时，着重观察痛利舒颗粒对关节炎大鼠的踝关节肿胀程度的改善作用，并测定TNF-α和IL-6的浓度，探究TNF-α和IL-6水平与急性痛风性关节炎的关系。

痛利舒颗粒为临床经验方，茵陈、泽泻、栀子三君药相合，共奏清热利水渗湿、止痛解毒之效，丹参、葛根以活血化瘀，牛膝发挥其引经报使之功。全方具有清热利湿、化瘀止痛、益气滋阴之效。实验结果表明，痛利舒颗粒各剂量组能有效缓解关节炎大鼠踝关节肿胀程度，显著降低大鼠血清中的TNF-α、IL-6水平，提高小鼠的痛阈值，降低小鼠的耳肿胀程度，说明痛利舒颗粒具有良好的消肿镇痛抗炎作用。综上所述，痛利舒颗粒对急性痛风性关节炎具有良好的治疗作用，且作用强度与剂量具有一定的量效关系，但对于降低某些指标不如西药明显，应进一步开发研究该经验方，探究其在防病、治病方面的新用途或新优势。