车宏伟 杨海宁 王登才 郑稳生

中国医学科学院药物研究所药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室，北京 100050

疏清处方是以经典名方“白虎汤”为基础加减而长期应用的方剂，由生石膏、大青叶、桑叶、芦根、甘草组成，具有清热解毒、宣泄润肺等功效[1-2]，临床用于小儿外感风热、上呼吸道感染等疗效显著，但因疏清颗粒开发较早，制备工艺落后，相关标准较低，难以控制药品质量。本研究通过定性、定量法对疏清颗粒质量进行全面考察，以期提高质量标准，为药品生产检验提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BSA423S-CW分析天平；SHB-Ⅲ循环水泵；HH-S恒温水浴锅；DTC-27超声仪；硅胶G、GF254薄层板；ZF-C三用紫外分析仪；日立chromaster 5430液相；DAD检测器。

1.2 试药

大青叶（批号：121367-201403）、甘草（批号：120925-201109）、芦根（批号：121107-201505）、桑叶（批号：121123-201305）、靛玉红（批号：110717-200204）购买于中国食品药品检定研究院；甘草酸单铵盐（上海古朵生物科技有限公司，批号：X4860010）；甘草苷（上海古朵生物科技有限公司，批号：C21H2209）；疏清颗粒（吉林华康药业，批号：20171213、20171230、20180305）；娃哈哈纯净水；盐酸；高效液相色谱（HPLC）甲醇（Fisher），其他试剂均为分析级。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱（TLC）鉴别

2.1.1 桑叶 取本品各3 g，研磨，加三氯甲烷-甲醇（2∶3）50 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取桑叶对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。除去桑叶，模拟处方，采用完全相同方法制备阴性对照液。照2015年版 《中国药典（四部）》通则 0502[3]试验，吸取上述 3 种溶液各 4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（4.8∶5.5∶1.1）为展开剂，展开，取出，晾干。 喷以3%氢氧化钠溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视[4]。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图中箭头所示）。阴性对照色谱相应的位置上，未见任何斑点，表明该鉴别专属性强，具较好的重现性。见图1。

图1 桑叶薄层色谱图谱

2.1.2 甘草 取本品各5 g，加甲醇50 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，再以1%氢氧化钠溶液萃取2次[5]，每次20 mL，合并碱液，用盐酸调pH值至中性，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，以20 mL水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1 g，加乙醚 40 mL[6]，回流 1 h，滤过，药渣加甲醇 30 mL，回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇溶液，用水洗涤3次，每次10 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为对照药材溶液。取甘草苷，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。除去甘草，模拟处方，采用完全相同的方法制备阴性溶液，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一GF254薄层板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）作为展开剂[7-8]，展开，取出晾干，在紫外光灯（254 nm）下进行检视。供试品色谱中在与对照药材和对照品在相同位置显示相同颜色的斑点，在与阴性对照色谱中相应的位置上，未见任何斑点，表明该薄层鉴别专属性强，重现性好。见图2。

图2 甘草薄层色谱图谱

2.1.3 大青叶 取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成0.1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液，取大青叶对照药材1 g加三氯甲烷50 mL超声30 min，滤过，挥干滤液，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。除去大青叶，模拟处方，采用完全相同的方法制备阴性溶液。吸取对照品溶液、对照药材溶液及鉴别项“2.1.1”下的供试品溶液、阴性溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）为展开剂，展开，取出晾干，在日光下检识[9]。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图中箭头所示），阴性色谱中相应的位置上，未见任何斑点，表明该薄层鉴别专属性强，重现性好。见图3。

图3 大青叶薄层色谱图谱

2.1.4 芦根 取本品各10 g，加三氯甲烷回流提取2次，每次50 mL，滤过，合并滤液，回收溶剂，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取芦根对照药材1 g，加三氯甲烷25 mL，超声30 min[10]，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解。除去芦根，模拟处方，采用完全相同的方法制备阴性溶液，分别吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4.5∶1.5）为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸-乙醇试液，105℃加热后，置紫外灯（365 nm）下[11]检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图中箭头所示），在与阴性对照色谱中相应的位置上，未见任何斑点，表明该鉴别专属性强，重现性好。见图4。

图4 芦根薄层色谱图谱

2.2 含量测定

2.2.1 测定制剂中靛玉红（A）、甘草苷（B）的含量 色谱条件：流动相A比B=甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液（33.5∶33.5∶33）比乙腈-冰醋酸 0.05%（60∶40）[12]；检测波长A比B=289 nm比238 nm；流速1.0 mL/min；柱温35℃，进样量 10 μL。

2.2.2 样品溶液配制 A对照品溶液：精密称取A对照品，加三氯甲烷-甲醇（7∶3，V/V）[13]制成约 12 μg/mL 的溶液，摇匀，再精密吸取10 mL，加甲醇制成约12 μg/mL的溶液，即得。B对照品溶液：精密称取B对照品，加甲醇制成约1 mg/mL的溶液。供试品溶液A：取3批本品，取1.5 g，置50 mL量瓶中，加甲醇超声30 min，放冷，加甲醇至刻度，即得。供试品溶液B：取3批本品，取1.5 g，置100 mL锥形瓶中，加8%盐酸溶液30 mL，再加三氯甲烷30 mL，回流提取1 h[14]，放冷，置分液漏斗中，取三氯甲烷层液，酸液用三氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，挥干溶剂，残渣加甲醇至10 mL量瓶，即得。

2.3 A方法学建立

2.3.1 专属性实验 分别精密吸取供试品溶液，大青叶阴性对照溶液，A对照品溶液，注入HPLC仪测定，结果表明，大青叶阴性对照无干扰，专属性良好。

2.3.2 标准曲线的制备 精密吸取“2.2”项下A对照品溶液 2、4、8、10、12、16 μL，分别进样测定，以对照品含量为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程 y=1471.2799x-52.6798（r＝ 0.9992），结果表明靛玉红在0.057～0.46 μg/mL范围内线性良好，符合外标法要求。

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2”项下供试品溶液，连续进样6次，测得峰面积RSD为1.19%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取“2.2”项下供试品溶液，分别于制备后 0、2、4、6、12、24 h，按同项下的色谱条件测定，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.5 重复性试验 取本品（批号：20171213），6份，各1.5 g，精密称定，置 50 mL锥形瓶中，按“2.2”项下供试品制备方法制备，取续滤液，即得。表明本方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验 取本品（批号：20171213），6份，各20 g，加入一定量的对照品，按“2.2”项下供试品制备方法制备，取续滤液，即得。见表1。

表1 靛玉红回收率试验

2.3.7 疏清颗粒三批小试含量测定 取三批样品各1.5 g，按“2.2”项下供试品溶液制备方法制备，测定结果见表2。

表2 疏清颗粒三批小试含量测定（μg/g）

2.4 B方法学建立

2.4.1 B专属性实验 分别精密吸取供试品溶液，甘草阴性对照溶液、B对照品溶液，注入HPLC仪测定。结果表明甘草阴性无干扰，专属性良好。

2.4.2 标准曲线的制备 精密吸取“2.2”项下B对照品储备液，置于容量瓶中，加甲醇制成 0.02、0.04、0.08、0.1、0.12、0.14 mg/mL的溶液测定，以含量为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程y=356 584x-2427.7（r＝ 0.9995），结果表明甘草苷在0.2～1.4 mg/mL范围内线性良好，符合外标法要求。

2.4.3 精密度试验 精密吸取“2.2”项下供试品溶液，按同一项下色谱谱条件，连续进样6次，峰面积RSD为1.05%，表明精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取“2.2”项下供试品溶液，分别于制备后 0、2、4、6、12、24 h 测定，峰面积 RSD 为0.96%（n=6）<2%，表明供试品在24 h内基本稳定。

2.4.5 重复性试验 取本品（批号：20171213）6份，各1.5 g，置50 mL锥形瓶中，按“2.2”项下供试品制备方法制备，取续滤液，即得，表明本方法重复性良好。

2.4.6 回收率试验 取本品（批号：20171213）6份，各20 g，加入一定量的对照品，按“2.2”项下供试品制备方法制备，取续滤液，即得。测定结果见表3。

表3 甘草苷回收率试验

2.4.7 疏清颗粒三批小试含量测定 称取三批样品各1.5 g，按“2.2”项下供试品制备方法制备。测定结果见表4。

表4 疏清颗粒三批小试含量测定结果（μg/g）

3 讨论

TLC广泛用于中药材、提取物、制剂等质量的定性鉴别，随着检测技术的不断精密化，目前质量控制多偏向于液相[15]、气相[16]等技术的使用，但TLC因价格低廉，实验迅速仍被广泛地应用于药物研发中。

桑叶鉴别中，分别比较了三氯甲烷、甲醇等不同溶剂的提取效果，最终以三氯甲烷-甲醇（2∶3）超声30 min 提取最完全，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（4.8∶5.5∶1.1）为展开剂，Rf值适中，各斑点清晰无拖尾。

芦根具有清热泻火、生津止渴之功效[17]，回流提取优于超声提取，以环己烷-乙酸乙酯（5.2∶1.5）为展开剂，分离效果较好，Rf值适中，且阴性无干扰。

原标准中靛玉红为质控指标，但对大青叶未做薄层鉴别，本文补充大青叶的TLC鉴别。因靛玉红属双吲哚类生物碱[18]，在乙醚、三氯甲烷中溶解度高，故采用三氯甲烷富集。因靛玉红本身是紫红色，TLC鉴别时在日光下颜色明显，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）为展开剂，阴性无干扰。原标准中有石膏的鉴别、检测项，本文通过验证，甘草中含有草酸钙方晶[19-20]，阴性有干扰因此舍弃。分别考察甲醇-乙腈-水系统的检测效果，发现在相同色谱条件下，各自分离度较佳，但都有拖尾现象，加入磷酸、冰醋酸，拖尾改善。

本研究通过TLC对疏清颗粒全方中药材进行鉴别，新增桑叶、芦根、大青叶等鉴别项，甘草苷为质控项。结果表明本法简单易行，斑点清晰，分离度好、重复性好，专属性强且斑点清晰，阴性无干扰；所建立的疏清颗粒质量标准高于原标准，提高了疏清颗粒的质量，为以后质量控制提供依据。