郑向炜 吴佩颖 王 军 王丹丹 阮克锋 梁 爽 冯 怡

1.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海 201203；2.上海上药杏灵科技药业股份有限公司，上海 201703

银杏酮酯（GBE）制剂现在已被广泛用于心脑血管临床，GBE含有6%的银杏总内酯，包括二萜类和倍半萜类，该类物质为银杏特有成分[1-2]。药代动力学研究显示该类成分不但能入血，而且能入脑[3-4]，故对其心脑血管活性有着不可替代的作用。药效学研究显示它对免疫系统有调节作用，对中枢神经系统、缺血损伤有保护作用，并有抗休克、抗过敏及抗炎作用[5-14]。药理学研究显示该类萜内酯对血小板活化因子有显著的特异性拮抗活性，其中银杏内酯B最显著[15-20]。所以开发高纯度银杏内酯制剂具有重大现实意义。本研究利用硅胶柱色谱-重结晶法使总内酯纯度提高到≥80%。符合注射剂原料含量的要求。

1 仪器与试药

GBE由上海上药杏灵科技药业股份有限公司提供，其中银杏总内酯（银杏内酯 A、B、C、白果内酯）HPLC纯度6.35%；银杏内酯A（中国食品药品检定研究院，批号：110862-201310）；银杏内酯 B（中国食品药品检定研究院，批号：110863-201410）；银杏内酯C（中国食品药品检定研究院，批号：110864-201307）；白果内酯（中国食品药品检定研究院，批号：110865-201306）。硅胶薄层板（青岛海洋化工厂分厂，批号：20160102）；硅胶（青岛海洋化工厂分厂）；玻璃色谱柱（规格：1 cm×20 cm，5 cm×65 cm）；高效液相色谱仪Agilent 1200 系列（Agilent Technologies，美国）；自动进样器（Agilent Technologies，美国）；四元泵（Agilent Technologies，美国）；ELSD 检测器（BUCHI，美国）；色谱纯甲醇[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；其他化学试剂除特殊说明外均为化学纯。

2 方法与结果

2.1 银杏总内酯含量测定方法

依照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D）测定。

2.1.1 色谱条件 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（21∶79）为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取银杏内酯A、B、C和白果内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含上述对照品1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取供试品150 mg，精密称定，置索氏提取器中，加丙酮180 mL，加热回流3次，提取液减压浓缩至干，残渣用醋酸甲酯30 mL溶解，移至分液漏斗中，剩余残渣再用水15 mL溶解，并入同一分液漏斗中，振摇，分取乙酸甲酯液，水溶液再用乙酸甲酯30 mL振摇提取。合并醋酸甲酯提取液，减压浓缩至干，残渣用流动相溶解，移至5 mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

2.1.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液5、20 μL，供试品溶液注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，即得。

2.2 薄层色谱系统考察

在各色谱系统中，二氯甲烷-甲醇系统在高效硅胶薄层板上对GBE中4个银杏内酯成分的分离效果较好，故选择该层析系统作为柱色谱的分离系统。见表1。

表1 不同色谱系统结果

2.3 柱色谱填料种类考察

取 5 g GBE 粉末，二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，取200～300目硅胶15 g拌样。另取200～300目硅胶，二氯甲烷浸泡过夜后，湿法装柱，柱体积12.5 mL，样品/填料质量比为1∶40，干法上样，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脱，收集、合并含银杏内酯 A、B、C及白果内酯的流份。

选取200～300目中性氧化铝，二氯甲烷浸泡过夜后，湿法装柱，柱体积12.5 mL，按样品/填料质量比1∶30，二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，拌样，干法上样，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脱，收集、合并含银杏内酯A、B、C、白果内酯的流份。

在相同的柱体积下，中性氧化铝柱的上样量和回收率均显著低于硅胶柱；而硅胶柱虽然上样比例比中性氧化铝柱高，但对银杏内酯的含量提高倍数仍高于中性氧化铝柱，故选择200～300目硅胶作为柱层析的色谱填料。见表2。

表2 填料种类筛选结果

2.4 硅胶柱色谱填料粒度考察

选择 100～200、200～300 目两种硅胶进行考察，过程如“2.3”项所示。200～300目硅胶柱色谱所得产物的含量较100～200目的高21.1%，但回收率却相近，故选择200～300目硅胶为柱色谱填料。见表3。

表3 填料粒度考察结果

2.5 硅胶柱色谱洗脱剂比例考察

考察二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1）两种不同比例洗脱，如“2.3”项操作。结果显示比例为40∶1时，银杏内酯A、B以及白果内酯被洗脱下来，35∶1时银杏内酯C被洗脱下来，根据薄层色谱合并流份。所合并的流份银杏总内酯的含量较高，回收率适中。故选择洗脱剂比例为二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）。 见图 1。

2.6 硅胶柱色谱上样比例考察

选择 1∶30、1∶50 两种比例考察，过程如“2.3”项所示。结果显示，以1∶50的上样比例进行柱色谱，所得银杏总内酯的含量比按1∶30的高10.7%，但回收率却相近，故选择上样比例为1∶50。见表4。

图1 硅胶柱色谱洗脱剂筛选试验HPLC-ELSD图

表4 硅胶柱色谱上样比例考察结果

2.7 验证实验

经过单因素考察确定硅胶柱色谱各关键参数后，进行了100 g GBE粉末的放大验证试验，所得银杏总内酯部分含量为71.3%，回收率为62.3%，见图2。

上述实验结果说明该柱色谱工艺稳定，重现性好。故硅胶柱色谱的工艺确定为：GBE粉末用二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，取 1∶3 比例的 200～300 目硅胶拌样，干法上样。取200～300目硅胶，二氯甲烷浸泡过夜，湿法装柱，样品/填料质量比为1∶50，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脱，TLC 监控收集、合并含银杏内酯A、B、C及白果内酯的流份。

图2 硅胶柱色谱制备高纯度银杏内酯验证实验HPLC-ELSD图

2.8 精制工艺考察

经多次筛选，最终选择丙酮-水（1∶1，V/V）作为重结晶溶剂。将柱色谱所得产物加10倍量丙酮-水（1∶1，V/V）超声溶解，4℃以下静置过夜，即可获得结晶，上述100 g GBE粉末原料经单次硅胶柱色谱及单次重结晶后，所得产物的银杏总内酯含量高达81.4%，并且此时总回收率为55.4%。见图3。

3 讨论

目前，有报道利用聚酰胺、碱式氧化铝柱色谱制备银杏内酯[21]，但均未使其纯度提高到≥80%，本研究成功达到该目标。

图3 银杏内酯重结晶HPLC-ELSD图

本研究在柱色谱过程中对流速的控制为常规的4 BV/h，对径高比也采取了常规参数（1∶10），从研究结果看，达到了预期目的。