魏 蜜， 朱洁倩， 陈嘉敏， 金文闻， 傅本重， 王立华， 李国元

(1.湖北工程学院生命科学技术学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北孝感 432000；2.华中科技大学生命科学与技术学院/资源生物学与生物技术研究所，湖北武汉 430074； 3.武汉生物技术研究院，湖北武汉 430075)

玛咖(Lepidiummeyenii)是原产于南美洲安第斯山脉的十字花科独行菜属草本植物[1]。玛咖依据根茎外皮颜色差异分为紫色、黄色、白色、红色等不同栽培品种，玛咖根营养及生物活性成分丰富，具有抗压力、抗疲劳、抗抑郁、提高生育力等多种保健功效[2-3]。

玛咖病害主要有霜霉病、根肿病、病毒病、根腐病等，国内外对玛咖病原菌及病理的研究报道相对较少[4]。2015年8—10月，笔者在全国多个玛咖种植基地发现，玛咖易患根腐病，会给栽培者造成一定的经济损失。为明确玛咖根腐病的病原物，笔者对玛咖根腐病样品进行分离、纯化，并完成柯赫氏法则验证分析。本研究以期为玛咖病害的检测鉴定提供参考，为促进玛咖的科学种植和田间管理提供参考，为更好地开发利用玛咖药食两用的效果提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玛咖根腐病样品采自云南省丽江市海拔2 700 m的华中科技大学校企合作玛咖种植研究基地，玛咖植株经华中科技大学付春华副教授鉴定出。

1.2 病原菌的分离与纯化

采用常规的组织分离法[5]进行病原菌的分离和纯化，从病样病健交界处切取长约3 cm的组织，用清水冲洗表面杂物，置于0.1%酸性氯化汞水溶液中2 min，取出用无菌水冲洗2次；用70%乙醇处理30 s后，再用无菌水冲洗3次，无菌条件下接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和溶菌肉汤(LB)平板培养基上。分别倒置放置在28 ℃和32 ℃恒温培养箱中培养。待菌落长出后挑取不同的单菌落进一步划线培养，转接纯化3～5次。将纯化后的单菌落编号并放置在4 ℃保存备用。

1.3 病原菌的致病性

分别采用离体块茎组织接种法和盆栽试验进行致病性研究。离体块茎组织接种：将采回的健康玛咖块茎用无菌水洗净，切成3 cm×3 cm×3 cm，置于75%乙醇中30 s，无菌水冲洗后，置于0.1% 氯化汞溶液中浸泡20 min，再用无菌水冲洗。在超净工作台中，用紫外线照射垫有滤纸的培养皿 30 min，用 2 mL 无菌水浸润滤纸，每个培养皿放2块样品，用灭菌的 1 mL 枪头在玛咖块茎中央戳1个小孔，深度为2 mm，分别加入 10 μL 病原菌孢子悬液(浓度为1.0×107个/mL)，重复5次，用封口膜将培养皿口封住，加入 10 μL 无菌水的作为空白对照，放入28 ℃培养箱中培养，观察并记录发病情况。盆栽试验：将试验盆中健康的玛咖植株(生长7个月)用 10 mL 浓度为1.0×107个/mL的病原菌孢子悬浮液进行伤口接种，置于 25 ℃ 生化培养箱中，12 h光照处理，重复5次，同样以无菌水接种植株为对照，每天观察并记录发病情况。

1.4 病原菌的形态鉴定

观察平板菌落及显微条件下病原菌菌丝和孢子的形态，分别测量100个病原菌孢子的大小和菌丝直径，并记录拍照。参照《真菌鉴定手册》[6]和相关文献[7-9]，对各种孢子的形态特征进行对比分析和鉴定。

1.5 病原菌的脂肪酸组成分析

病原菌菌落收集培养基(沙氏葡萄糖琼脂培养基)、脂肪酸提取试剂(皂化试剂、甲基化试剂、萃取试剂和洗涤试剂，美国Fisher公司提供)、脂肪酸甲酯混合物标样(美国MIDI公司提供)；制得的脂肪酸样品由Agilent 6890型气相色谱系统检测，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；检测结果及数据比对分析通过微生物细胞脂肪酸成分鉴定软件MIS4.5和LGS4.5完成。

1.6 病原菌的分子鉴定

病原菌的DNA提取参考何月秋的研究方法[10]。分别采用真菌的通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)/ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′)[11]，延长因子序列分析引物ef1[5′-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3′]/ef2[5′-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3′][12]和RNA聚合酶II第二大亚基(RPB2)序列分析的2对引物5f2[5′-GGGG(A/T)GA(C/T)CAGAAGAAGGC-3′]/7cr[5′-CCCAT(A/G)GCTTG(C/T)TT(A/G)CCCAT-3′]和7cf[5′-ATGGG(C/T)AA(A/G)CAAGC(C/T)ATGGG-3′]/11ar[5′-GC(A/G)TGGATCTT(A/G)TC(A/G)TC(C/G)ACC-3′][13]进行PCR扩增，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的PCR扩增试剂盒(NO：B639297)进行试验，PCR反应总体系为51 μL，反应液为DNA 2 μL，ITS4/ITS5[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]各2 μL、Mix 25 μL、双蒸水20 μL。 PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共设35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；延长因子序列分析时换ef1/ef2为引物，用量相同；RPB2序列分析时分别换 5f2/7cr 和7cf/11ar为引物，用量相同。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示记录电泳结果。PCR产物委托天一辉远生物科技有限公司进行纯化和测序。

2 结果与分析

2.1 病原菌致病性验证

病原菌经过分离、纯化后，获得一种在PDA培养基上呈圆形，等径生长的菌落。该菌落生长初期为无色或灰白色，后渐变为紫红色，培养基基底中间呈褐色，外围呈紫红色，边缘整齐(图1-A、1-B)。菌丝细长、分枝、分隔、浓密(图1-C)。通过分离物的孢子悬液接种可使离体块茎和盆栽中的玛咖植株发病，且发病率为100%。植株发病症状与自然发病症状相似(图2)，再次分离的病原物与自然发病分离的病原物一致。

2.2 病原菌形态鉴定

在PDA培养基上，菌落呈圆形，菌丝生长茂盛，紧凑，初期无色，后在中心位置变为紫红色，逐步向外围扩展。菌丝有隔，分生孢子无色透明，大型分生孢子呈镰刀形，稍弯曲，两端渐细，具有2～5个隔膜，多为5个(图1-C)。经显微测量，病原菌分生孢子大小为(2.5～6.0) μm×(8.2～22.3) μm，平均值为14.43 μm×4.1 μm；菌丝直径为2.5～5.6 μm，平均值为 4.1 μm。依据《真菌鉴定手册》[6]和参考文献[7-9]，初步确定该分离物属于半知菌亚门，瘤座菌目，镰刀菌属。

2.3 病原菌的脂肪酸鉴定

相似度(similarity index，简称SI)是指待测菌株与系统谱库中标准菌株数值的匹配程度。待测病原菌的脂肪酸气相色谱如图3所示，其中有18个组分与数据库中标准菌株的组成类似。系统比对结果(表1)表明，待测病原菌与顶孢霉菌属、镰刀菌属的匹配度较高，相似度分别达到 0.696、0.625。一般来说，以最高SI菌种名称作为鉴定结果，但当其报告的几个菌种的SI比较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。根据“2.2”节中对病原菌形态特征的鉴定，初步判断该病原菌为镰刀菌。

2.4 病原菌的分子鉴定

对分离的病原菌进行分子鉴定， 将测得的rDNA-ITS序列(片段长度为557 bp，登录号KU936793)与GenBank中已知序列进行比对，选取9株菌株用ClustalX 2.1进行多序列比对分析，利用MEGA 6.0软件采用最大似然法进行系统发育树构建和聚类分析。如图4所示，菌株ROT-2与GenBank中登录号为KR047071.1、KP265365.1和FJ481029.1菌株的同源性均很高，不能判断到底属于镰刀菌属的哪个种，因此继续对该菌株进行延长因子序列和RPB2序列分析，将测得的TEF序列(片段长度为649 bp，登录号KU999088)与GenBank中已知序列进行比对，结果显示，ROT-2与GenBank中Fusariumavenaceumstrain CC39(EU744842.1)，Fusariumavenaceumisolate M247(KP400697.1)和Fusariumavenaceumstrain F087(JX534426.1)菌株的同源性均达到99%。同时将测得的RPB2序列(片段长度为760 bp)与GenBank中已知序列进行比对，结果(图5)显示ROT-2与GenBank中Fusariumavenaceumstrain BBA 64151(HQ728167.1)和Fusariumavenaceumstrain NRRL 54939(JX171663.1)菌株的同源性均达到100%。结合形态、部分生理生化特征以及rDNA-ITS、TEF、RPB2序列分析，可鉴定病原菌ROT-2属于燕麦镰刀菌，并命名为F.avenaceumROT-2。

表1 脂肪酸鉴定结果

3 结论与讨论

本研究对采自云南省丽江市玛咖种植基地的玛咖根腐病样品进行分离纯化，然后对纯化的病原物进行柯赫氏法则验证工作，依据形态学特征、脂肪酸组分分析以及rDNA-ITS、TEF、RPB2序列分析，将其鉴定为燕麦镰刀菌。形态学特征鉴定主要参考魏景超主编的《真菌鉴定手册》[6]和参考文献[7-9]，对分生孢子形态、大小、颜色等主要特征进行比较分析，分子鉴定除了采用真菌鉴定的通用引物ITS4/ITS5进行rDNA-ITS序列分析外，还采用鉴定镰刀菌属的特异性引物ef1/ef2进行延长因子TEF序列分析和RPB2序列分析，该结果为首次报道燕麦镰刀菌为玛咖根腐病病原菌。

镰刀菌在自然界中分布广泛，不同国家和地区镰刀菌的种类和致病性存在较大差异。研究报道，燕麦镰刀菌可引发黑龙江省水稻立枯病[14]，也可引发青海省蚕豆根腐病[15]，还是黑龙江省马铃薯干腐病和甘肃省马铃薯枯萎病的病原菌之一，会造成一定的经济损失[16-17]。本研究从云南省丽江市的著名经济作物玛咖根腐病样品中筛选分离到1株病原菌，并鉴定为燕麦镰刀菌，回接试验表明，该菌株可以导致健康玛咖组织发生根腐病，产生与病株相同的症状，从接种的病株中以相同的方法也可分离出病原菌，且其特征与原病株分离物完全相同。本研究为开展玛咖根腐病病害的深入研究和防治奠定了理论基础，为解决玛咖病害识别及科学防治提供了一定的参考，对保护、开发利用玛咖资源有较大意义。