郑学斌， 张清科， 朱咏梅， 竺俊全

(1. 宁波大学 教育部应用海洋生物技术重点实验室, 宁波 315211； 2. 浙江省新昌县水产技术推广中心, 新昌 311300)

精子活力是精子生理特性的主要研究内容，也是精子质量检测的重要指标；精子活力与受精能力密切相关[1]。鱼类精子的活力可通过测定精子的激活率、运动程度、运动时间及寿命等来确定。探明环境因子对鱼类精子活力的影响不仅有利于阐明精子的生理特性，而且也有助于人工授精中精子激活液的配制及精子低温保存用稀释液成分的确定[2]，对其人工繁殖及精子冷冻均有重要的参考价值[3-4]。目前，经济鱼类精子活力或精子生理特性的研究已见较多报道，如在淡水鱼类中已见对中华鲟(Acipensersinensis)[5]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[6]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)[8]、细鳞斜颌鲴(Plagionathopsmicrolepis)[9]、光唇鱼(Acrossocheilusfasciatus)[10]等种类精子活力或生理特性的研究报道。

马口鱼(Opsariicjthysbidens)属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鱼丹亚科(Danioninae)、马口鱼属(Opsariichthys)，俗称山鱤、桃花鱼、大口扒等，是一种广泛分布于东亚江河、湖泊及山涧溪流等清澈水体中的小型经济鱼类，喜集群生活，以小鱼、小虾、水生昆虫等为食。马口鱼肉质肥嫩，味道鲜美，营养丰富，颇受消费者喜爱。近年来，由于水环境的污染、捕捞过度等原因，导致马口鱼自然资源的衰退。因此，马口鱼的资源保护及增养殖技术开发受到重视。目前，对马口鱼的研究已见系统分类[11]、遗传[12-13]、胚胎发育[14]、消化系统结构[15]、营养成分分析[16]、人工繁殖及养殖技术[17]等方面，但马口鱼精子活力或生理特性的研究未见报道。本文通过显微观察法，研究了pH值、葡萄糖及离子等环境因子对马口鱼精子活力的影响，旨在积累马口鱼精子生理特性资料，为其人工繁殖及精子冷冻保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用马口鱼雄鱼于2017年7月取自浙江新昌县荣欣水产养殖场，挑选成熟度良好的雄鱼20尾，体长12.3～14.6 cm，体重22.9～32.1 g，暂养于水泥池内，供采精用。

1.2 方法

1.2.1 实验溶液的配制

1)不同pH值溶液的配制。pH值梯度分13组，每组取500 mL去离子水，滴加1 mol/L的HCl或NaOH，配制pH值梯度为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10的实验溶液。

2)不同浓度葡萄糖、KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液的配制。往去离子水中分别添加0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 g的葡萄糖、KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2，定溶至500 mL，配制成浓度梯度为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 g/L的葡萄糖、KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液。

3)不同浓度Cd2+溶液的配制。往去离子水中添加0.407 7 g CdCl2，定溶至500 mL，配制成Cd2+浓度为500 mg/L的母液，依次取100 mL母液逐级稀释，配制成Cd2+浓度梯度为0.000 5、0.005、0.05、0.5、5、50和500 mg/L的实验溶液。

1.2.2 精液的采集

用洁净的干毛巾擦干马口鱼雄鱼生殖孔周围体表，轻压鱼腹使精液自然流出，用移液枪吸取无尿污精液于离心管中，冰浴保存，实验尽快进行。

1.2.3 精子活力观察

用移液枪吸取微量精液于载玻片上，滴加事先配制好的实验溶液并迅速用枪头将其搅匀，然后在光镜下观察精子的激活率、运动时间及寿命。精子的激活率以激活起始时给定视野内被激活精子数量占全部精子数量的百分数计算。精子的运动时间以精子激活开始至90%的精子原地颤动为止的时间计算。精子的寿命以精子自然激活开始至90%的精子停止运动为止的时间计算。实验重复3次。

1.2.4 数据处理

实验数据的均值、标准差及单因素方差分析采用SPSS 19.0完成，以P=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 精液中精子浓度

用血球计数板-显微观察法测出马口鱼精液中精子的平均浓度为(1.227±0.13)×1010/mL。

2.2 pH值对马口鱼精子活力的影响

温度27℃～28℃，pH值对马口鱼精子活力的影响见表1。pH值在4.0～10.0范围内均有一定比例的精子被激活；pH值在5.5～8.5范围内，激活率大于50%；pH值在6.0～7.5范围内，激活率大于60%，无显著差异；pH值为6.0时，精子激活率、运动时间及寿命分别达(77.67±3.51)%、(43.00±2.08)s和(47.67±1.00)s。

表1 pH值对马口鱼精子活力的影响

注：*差异显著,P<0.05；**差异极显著,P<0.01；pH=6.0激活液为对照组；下同

2.3 葡萄糖溶液对马口鱼精子活力的影响

温度27℃～28℃，不同浓度葡萄糖溶液对马口鱼精子活力的影响见表2。葡萄糖浓度在1～5 g/L范围内，精子未能激活。葡萄糖浓度在6～10 g/L范围内，虽有一定比例的精子被激活，但激活率总体较低，与对照组差异显著；葡萄糖浓度在9 g/L时，精子激活率、运动时间及寿命分别为(41.66±7.02)%、(9.33±8.62)s和(51.00±19.70)s，而且仅此组观察到精子激活后的正常运动，其他组精子激活后只原地颤动。

表2 不同浓度的葡萄糖溶液对马口鱼精子活力的影响

2.4 KCl、NaCl、MgCl2和CaCl2溶液对马口鱼精子活力的影响

温度27℃～28℃，不同浓度的KCl、NaCl、MgCl2和CaCl2溶液对马口鱼精子活力的影响见表3～5。KCl溶液浓度在2～8 g/L范围内均有精子被激活，其中在5 g/L时精子激活率、运动时间及寿命分别达(80.00±5.29)%、(108.67±18.04)s和(697.00±47.03)s，与对照组差异显著；在1、9和10 g/L KCl溶液中精子未被激活。NaCl溶液浓度在2～7 g/L范围内均有一定比例精子被激活，其中在4～5 g/L时精子激活率相对较高，运动时间和寿命较长；NaCl 4 g/L时，精子激活率、运动时间及寿命分别为(60.33±7.77)%、(33.00±13.11)s和(208.00±54.84)s；在1 g/L及8～10 g/L NaCl溶液中精子未被激活。MgCl2溶液浓度在1～5 g/L范围内时，有一定比例精子被激活，但仅在原地颤动。CaCl21～5 g/L范围内，精子有一定比例被激活，CaCl21g/L时，精子的激活率、运动时间及寿命分别达(50.33±1.53)%、(31.00±1.00)s及(34.67±2.52)s。MgCl2和CaCl2溶液浓度≥6 g/L时，精子未被激活。

表3 不同浓度KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液对马口鱼精子激活率的影响

表4 不同浓度KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液对马口鱼精子运动时间的影响

2.5 重金属Cd2+对马口鱼精子活力的影响

温度27℃～28℃，不同浓度的Cd2+溶液对马口鱼精子活力的影响见表6。在0.000 5～5 mg/LCd2+浓度范围内均有较高比例的精子被激活，被激活后，精子运动剧烈，对Cd2+非常敏感，快速运动过后立即死亡。随着Cd2+浓度的上升，精子的激活率、运动时间和寿命呈下降趋势，在50 mg/L及500 mg/L Cd2+浓度下，精子立即出现凝集致死现象。

表5 不同浓度KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液对马口鱼精子寿命的影响

表6 镉离子对马口鱼精子活力的影响

3 讨论

3.1 pH值对精子活力的影响

研究表明，大多数鱼类精浆pH值偏碱性，介于7.3～8.5之间[19]，酸性环境会减弱或抑制精子的活力，多数鱼类在偏碱性水体中精子活力较高。据研究，pH值低于5.5时草鱼精子不能激活[6]，pH值分别为8.64和8.5时，草鱼[6]和江鳕(Lotalota)[20]精子的活力最高；同样，pH值8.0时，黄颡鱼[7]、胭脂鱼[8]等鱼类精子的活力最高。本研究，马口鱼精子在pH值4.0～10.0内均有一定比例精子被激活，精子能够被激活的pH范围较广，对酸性环境具有一定的耐受性，并且，差异显著分析显示马口鱼精子激活与运动的适宜pH值为6.0～7.5，在pH值6.0时活力最好。从表7可见，马口鱼精子适宜的pH值与其他淡水鱼类有一定的差异，适宜的pH值范围相对较低。

3.2 葡萄糖对精子活力的影响

表7中，各种鱼类适宜的葡萄糖浓度差异较大，高体雅罗鱼[19]、江鳕[20]、乌原鲤[21]等鱼类在较高浓度的葡萄糖溶液中能被激活。研究表明，体外受精鱼类的精子能够利用外源性小分子单糖来补充自身能量的消耗[22]，这在葡萄糖对中华鲟[5]、高体雅罗鱼[19]、江鳕[20]、乌原鲤[21]等鱼类精子活力影响的实验中得到证实。然而，在胭脂鱼[8]、细鳞斜颌鲴[9]、光唇鱼[10]等鱼类精子生理特性的研究中并未得到类似结果，葡萄糖对其精子的活力无促进作用。本研究中，马口鱼精子在葡萄糖溶液的激活率不高、寿命也没有明显延长，可见，不同种鱼类对葡萄糖的吸收、利用是有差别的。

表7 部分淡水鱼类精子适宜的环境因子数值

3.3 离子对精子活力的影响

水体中的K+、Na+、Ca2+及Mg2+是激活鱼类精子的重要因子[23]，离子浓度的变化对鱼类精子活力的影响颇大[4]，并且，不同鱼类精子对相同离子的适应范围往往不同。

K+和Na+是鲤(Crprinuscarpio)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)等主要淡水鱼类精浆的主要组成部分，占元素组成的90%以上，在调节精浆渗透压和精子运动能力中起着重要的作用[24]。据研究，K+对鲑科鱼类精子活力具有明显的抑制作用[25-26]，相反，它对鲤科鱼类精子的活力具有一定的促进作用[27]。实验证明，适宜浓度的K+能延长细鳞斜颌鲴[9]、光唇鱼[10]、鲤鱼[27]、金鱼(Carassiusauratus)[27]等精子的运动时间和寿命。由表7可见，不同种鱼类精子适宜的KCl、NaCl溶液浓度不同。本研究中，马口鱼精子在5 g/L的KCl溶液中运动时间和寿命得到显著延长，其运动时间和寿命分别是pH值为6.0组的2.5倍和14.8倍，差异极显著，这说明适宜浓度的K+溶液对马口鱼精子的活力具有明显的提升作用。因此，在实际生产中，可用5 g/L的KCl溶液作为马口鱼人工授精的激活液，延长精子快速运动时间，提高受精率。除K+以外，Na+对马口鱼精子活力也有一定的促进作用，但其促进程度不及K+。类似的研究表明，适宜浓度的Na+溶液也能在一定程度上提高中华鲟[5]、黄颡鱼[7]、光唇鱼[10]、高体雅罗鱼[19]等精子的运动时间及寿命。

Ca2+和Mg2+对中华鲟[5]、细鳞斜颌鲴[9]精子活力有一定的抑制作用，而光唇鱼[10]精子在1～10 g/L的CaCl2及MgCl2溶液中均未能激活，但它们对胭脂鱼[8]、江鳕[20]、乌原鲤[21]精子没有表现出明显的抑制作用。可见，不同鱼类精子对Ca2+和Mg2+适应能力不同。据报道，Ca2+和Mg2+对鲤、团头鲂精子的活力均有抑制作用，且该抑制作用不是渗透压所引起，而是离子本身的作用[28]。在研究Ca2+对白斑狗鱼(Esoxlucius)精子活力影响的实验中也得出，Ca2+对其精子活力的影响与渗透压无关[29]。本研究也观察到类似现象，用MgCl2溶液激活马口鱼精子后，能被激活的精子只做原地颤动，而用CaCl2溶液激活马口鱼精子后，虽有一定的运动时间，但其激活率和运动时间均较低，精子活力受到抑制。Ca2+和Mg2+也是淡水鱼类精浆组成成分，但其含量极低(不到1%)[24]，其作用效果与K+和Na+不同，具体原因有待进一步研究。

在研究Cd2+对马口鱼精子活力影响的实验中发现，马口鱼精子的运动非常剧烈，快速运动过后立即死亡，其激活率、运动时间及寿命都随Cd2+浓度的升高呈逐渐下降趋势，在Cd2+浓度为50 mg/L及500 mg/L时，精子立即出现凝集致死，这说明Cd2+对马口鱼精子存在一定的毒害作用，高浓度的Cd2+可使其直接致死。类似的结果在中华鲟[5]及泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[30]精子生理特性的研究中也有报道，重金属Cu2+对中华鲟精子有很强的抑制作用，较低浓度的CuCl2溶液即可使精子很快死亡，而Cd2+对泥鳅精子活力的影响存在明显的浓度依赖性，即激活液中Cd2+浓度越高，精子的激活率就越低。