孔晶晶,孙玥,段炼

(太原理工大学 化学化工学院,山西 太原 030024)

0 引言

金属硫蛋白[1-5](Metallothioneine,简称MT)广泛存在于动物、植物、人体以及微生物体内,是一种低分子量(相对分子质量约6 kDa-7 kDa),富含半胱氨酸不含芳香性氨基酸和组氨酸、能被d10过渡金属离子如Zn、Cu、Cd诱导的金属结合蛋白,且理化性质基本一致。金属硫蛋白具有很多生物学作用其中包括清除氧自由基(ROS)、参与重金属离子代谢、解毒、金属离子的运输、维持金属离子浓度与维护细胞内稳态[6-7]。金属硫蛋白刚出现在大众视野的时候被认为仅存在于动物界,直到1977年Casterline和Barnett首次于大豆根中通过酶促合成发现植物金属硫蛋白,随后1987年Lane等从小麦胚胎中分离出Ec(earlycys-containing protein)蛋白,并证明其氨基酸序列与动物MTs相一致,且发现它们也具有金属离子解毒等相应功能,从而证明了植物体内也含有MTs,植物金属硫蛋白[8-10]才逐渐被普遍接受。后来人们又陆续从其他植物,如拟南芥、玉米、西红柿和棉花中发现有编码MTs的基因存在。与脊椎动物的金属硫蛋白相比,植物金属硫蛋白由于其具有序列的多样性和种类的复杂性成为近年来的研究热点,人们根据Cys残基的数目和其在N-末端区域的分布将植物金属硫蛋白分成四类。除少数特例外,Ⅰ型的植物MT1在其N端含有6个Cys残基。Ⅱ型MT在其N端含有8个Cys。 Ⅲ型MT在其N端含有4个Cys而C-末端Cys残基的分布遵循CXCXXXCXCXXCXC(其中X表示除Cys之外的任何氨基酸)的序列。Ⅳ型MT含有三个富含Cys的区域，每个区域含有五个或六个保守的Cys残基。随着科学技术的发展大多数植物金属硫蛋白如小麦Ec蛋白和拟南芥的MTs被纯化出来，但是因为其自身结构及配位环境的复杂性使得我们对植物金属硫蛋白结构、性质及功能的研究进展缓慢，目前谈论的植物MT的功能多是根据其表达行为进行的推测，如植物 MT可能在重金属的解毒、金属离子的运输、维持金属离子浓度及稳态等方面起作用[11-12]。

我国是世界稀土资源大国,同时稀土在农业、医药业等领域已得到越来越广泛的应用,为国民经济的发展做出了重大贡献。稀土离子的生物化学研究是从20世纪初稀土离子的毒害和防治开始的[13]。大量实验研究表明,稀土元素对植物的生长调节作用表现出“低促高抑”的“Hormesis”[14]效应,也就是说适宜剂量的稀土元素对植物的生长起到一定调节和刺激作用,表现为促进植物的生长、发育,而高浓度的稀土则对植物生长造成不良的影响,进而产生毒害作用,且呈现出明显的剂量——效应关系。关于稀土离子在植物体内发挥其剂量效应的靶蛋白应该是哪个或是哪几个一直以来都是稀土生物学研究的热点。日本学者Kawagoe[15]等以小白鼠为实验体,用氯化亚铈进行喂养,结果表明氯化亚铈能明显促进小白鼠肝脏MT含量的增加。复旦大学黄仲贤[16]教授也开展过稀土元素与大鼠MT作用的研究,结果表明,稀土离子(至少是Nd3+)在体外不能同金属硫蛋白有效结合,而在大鼠腹腔内注射镧及铕的氯化物和柠檬酸盐溶液,也不能有效地在体内诱发金属硫蛋白的产生,同时在体内也未发现结合稀土元素的金属硫蛋白,最终认为金属硫蛋白并不参与生物体内稀土元素的代谢过程。孟范平[17]等人进行了La3+对菲律宾蛤仔不同组织金属硫蛋白诱导的研究,结果表明La3+能够促进蛤仔MT的诱导,但对机体MT的诱导却存在一定限度。目前为止还没有稀土元素能否诱导植物体产生MT,或是稀土元素是否能与植物,特别是农作物体内的MT相互作用的报道。

玉米作为我国的重要的高产粮食作物及主要的饲料作物,其种植面积和总产量仅次于小麦和水稻居粮食作物的第3位,市场需求旺盛。1991年,de Framond[18]等报道了来自玉米的类金属硫蛋白基因(Gene Bank: P30571),并将其分类为Ⅰ类MT。四年后,Chevalier[19]在葡萄糖饥饿表达的条件下分离出六种不同的cDNA并命名为PZSS2,PZSS3,PZSS4,PZSS5,PZSS6,PZSS7,其中序列号为PZSS6(登录号:X82186)的cDNA与之前de Framond公布的玉米基因序列在核苷酸水平上几乎具有100%的同源性,从而验证了玉米金属硫蛋白(ZeamaysMetallothionein简称ZmMT1)的存在,经同源性比对,其属于Ⅰ型金属硫蛋白,故将其命名为Ⅰ型玉米金属硫蛋白(ZeamaysMetallothionein 1,简称为ZmMT1)。我们以de Framond[18]报道的Zeamys类金属硫蛋白的基因构建了重组质粒pGEX-6p-1-ZmMT1,首次建立了玉米金属硫蛋白原核表达体系,利用基因工程的方法表达纯化得到了大量的玉米金属硫蛋白(ZmMT1)纯品,着重探究了ZmMT1在体内对稀土离子及其他重金属离子的耐受性及在体外与这些金属离子的结合特性,为金属硫蛋白与稀土生物效应的相关性提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒与菌株

含有ZmMT1基因的重组质粒及菌液pGEX-6p-1-MT1由Sangon Biotech公司构建提供,目的基因片段含有限制性内切酶双酶切位点BamHI、XhoI,原核表达所选择的菌株为大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。

1.1.2 主要实验试剂

试剂:phosphate buffer saline(PBS)磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH 7.2-7.4);胰蛋白胨(Tryptone);酵母提取物(Yeast extract);Tris-Hcl;IPTG(1 mol/L);Coomassie brilliant blue G-250;L-Glutathione(Reduced);Bis(N,N’-Methylenebis(acrylamide);丙烯酰胺(Acrylamide);GST 亲和层析柱材料;Cd标准溶液(1 mL溶液含1 mg Cd);Zn(NO3)2.6H2O(0.01 mol/L);Lu3+(1mmol/L); La3+(1mmol/L)。

1.1.3 主要实验仪器

仪器:SCIENTZ-ⅡD 超声波细胞粉碎机;SW-CJ-1FD(标准型)单人垂直净化工作台;DYCZ-24DN 型迷你双垂直电泳槽;YXQ-LS-18S1不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器;D2012Plus台式高速小型离心机;DYY-6C型电泳仪电源;722S可见分光光度计;紫外分光光度计UV-1800型(日本岛津公司);722S可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米金属硫蛋白(ZmMT1)对不同金属离子耐受性测定

从-80℃冰箱中取出加甘油冻存的转化有pGEX-6p-1-ZmMT1 重组质粒的EscherichiacoliBL21 (DE3) 菌液以及pGEX-6p-1空白载体的EscherichiacoliBL21 (DE3) 菌液,于2组LB液体培养基中并标注为实验组与对照组,振荡过夜培养12～14 h。取上述过夜培养菌液转接至含氨苄青霉素(Ampicillin简称Amp)抗性的100 mL锥形瓶,振荡2h左右,当OD600达到0.6～0.8之间,加入IPTG诱导30 min左右,然后在该混合培养基中加入Lu3+、La3+、Zn2+、Cd2+等金属离子至终浓度为1 mmol/L,最后每隔1 h监测菌液OD600,连续监测9 h,并以未加入金属离子前的菌液作为空白对照。

1.2.2 不同金属离子对玉米金属硫蛋白(ZmMT1)的诱导表达

从-80℃冰箱中取出加甘油冻存的转化有pGEX-6p-1-ZmMT1 重组质粒的EscherichiacoliBL21 (DE3) 菌液,准备5个LB试管培养基,然后取其中一个为空白组,其余4个LB试管培养基中分别添加一定量的Zn2+、Cd2+、La3+、Lu3+至终浓度为50 μmol/L,过夜培养12～14 h。待菌体长至浑浊取上述过夜培养菌液转接至含Amp抗性的100 mL锥形瓶振荡,待OD600达到0.6左右时,加IPTG至终浓度为1 mmol/L进行诱导,每隔1 h监测菌液OD600,连续监测8 h。我们进一步探究了不同稀土离子浓度对玉米金属硫蛋白诱导表达的影响,取10个LB试管培养基标记为1、2、3、4、5,分别向其中加入不同浓度的Lu3+、La3+至终浓度为0.01、0.05、0.1、1、10 mmol/L连续培2 h,监测菌液OD600。

1.2.3 目的基因ZmMT1所编码蛋白质的表达及纯化

从-80℃冰箱中取出加甘油冻存的转化有pGEX-6p-1-ZmMT1重组质粒的EscherichiacoliBL21 (DE3)菌液,以1%的接种量转接至含Amp抗性的5mL LB液体试管培养基中,37℃,180 r/min振荡过夜培养。再1%的接种量将其转接至含Amp抗性的500 mL锥形瓶并在该培养基中添加一定量的Zn2+,振荡3 h左右,待OD600达到0.6～0.8之间,加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达,继续培养4 h。离心收菌,弃去上清留下沉淀,将沉淀用PBS 缓冲液重新悬浮,使菌液分散均匀,超声破碎仪破碎细胞,至菌液透亮,离心,收集上清加到亲和层析柱中进行纯化。菌体经诱导、超声破碎与离心、结合亲和层析柱后,加入Prescission protease对GST融合蛋白直接在层析柱上进行柱上过夜酶切,并下放纯化的ZmMT1。

1.2.4 脱金属ZmMT1的制备

为获取大量还原的脱金属硫蛋白(apo-ZmMT1)溶液,将纯化得到的ZmMT1粗品在含有一定量DTT、总体积为2 mL的Tris-HCl(100 mmol,pH 8.0)缓冲液中温育1 h,用1 mol/L HCl调至pH=2.0。以2 mL 的Tris-HCl(100 mmol,pH 8.0)缓冲液作为空白对照,对样品依次进行扫谱,记录数据。然后将还原处理的蛋白溶液超滤除去小分子蛋白、溶液及其他金属离子,得到的脱金属硫蛋白溶液备用。

1.2.5 紫外光谱法探究ZmMT1与不同金属离子的相互作用

取上述得到的apo-ZmMT1粗品,置于Tris-HCl(100 mmol,pH 8.0)缓冲液中,在氮气保护下分别用不同金属离子Lu3+、La3+、Zn2+、Cd2+滴定apo-ZmMT1,溶液在室温下培养直至观察到稳定的紫外吸收光谱(3～5 min),记录实验数据。

2 实验结果

2.1 ZmMT1对不同金属离子耐受性研究

我们研究了ZmMT1对稀土离子La3+、Lu3+以及生理元素Zn2+和重金属离子Cd2+的耐受性(图1)。实验组菌株pGEX-6p-1-ZmMT1与对照组菌株pGEX-6p-1对不同金属离子的耐受性如图1所示。

Fig.1 Tolerance of pGEX-6p-1-ZmMT1 in E. coli cells to La3+(A), Lu3+(B), Zn2+(C), Cd2+(D)图1 玉米金属硫蛋白对La3+(A)、Lu3+(B)、Zn2+(C)、Cd2+(D)耐受性

由图1(A、B、C、D)我们发现实验组菌株pGEX-6p-1-ZmMT1比对照组菌株pGEX-6p-1对稀土离子La3+、Lu3+以及具有生理效应的Zn2+和重金属离子Cd2+的耐受性都更高,而且耐受程度都随着时间的延长而增加,因此表明ZmMT1可以很好地耐受稀土离子以及Zn2+、Cd2+,为我们研究金属离子与玉米金属硫蛋白的相互作用提供一定的理论基础。金属硫蛋白种类不同其耐受性也不同,如Nezhad Rezvan Mohammadi[20]报道的水稻Ⅰ型金属硫蛋白在体外可以大量耐受、结合Zn2+、Cd2+、Pb2+但却对Cu2+几乎没有耐受性;黄国勇[21]报道的红树林Ⅱ型金属硫蛋白在体外可以大量耐受、结合Zn2+、Cd2+、Pb2+、Cu2+这与我们的结果相一致;这说明ZmMT1对重金属离子耐受及解毒机制,可以作为环境污染检测及植物修护的一项主要依据。

2.2 不同金属离子对ZmMT1的诱导表达

为了研究稀土生物效应与金属硫蛋白之间是否存在相关性,我们进一步探究稀土离子在体内是否可以诱导ZmMT1的产生。在含有不同金属离子Zn2+、Cd2+、La3+、Lu3+的培养基中加入1 mmol的IPTG来诱导ZmMT1的表达,结果如图2所示。

Fig.2 Induced expression of ZmMT1 by Zn2+、Cd2+、La3+、Lu3+ (A) and the effect of different La3+/Lu3+concentration on the ZmMT1 expression (B).图2 Zn2+、Cd2+、La3+、Lu3+对玉米金属硫蛋白的诱导表达(A) 及不同浓度La3+、Lu3+对ZmMT1表达的影响(B)

由图2A我们发现稀土离子La3+、Lu3+与生理元素Zn2+以及重金属离子Cd2+一样,均能诱导ZmMT1的表达,且诱导表达的程度差异不大。另外,金属离子存在与否也对ZmMT1的表达程度影响不大,这与de Framond[18]报道的即使没有暴露于高浓度金属离子的状态下也并不影响根部ZmMT1的表达相吻合。为了进一步明确稀土离子与金属硫蛋白表达之间的关系,我们进一步探讨了不同稀土离子浓度对ZmMT1诱导表达的影响,如图2B所示,我们发现较低浓度的稀土离子(< 0.05 mmol)对ZmMT1表达具有促进作用,且当稀土离子浓度约为0.04 mmol时诱导表达量达到最大。而稀土离子浓度过高则严重影响ZmMT1的诱导表达,当稀土离子浓度为10 mmol时,ZmMT1的表达完全受到抑制,这一现象与稀土元素对植物的生长调节作用表现出的“低促高抑”的“Hormesis”[14]效应相吻合,说明稀土生物效应与金属硫蛋白之间很有可能存在相关性。

2.3 ZmMT1的电泳检测

用IPTG诱导pGEX-6p-1载体中的ZmMT1表达,然后由提纯获得的产物经体积百分比为15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,结果如图3所示:泳道2(上清液)和3(沉淀物)条带与marker相比分子量大小约为34 kDa左右,表明其主要表达为可溶性融合蛋白形式(图3),与GST-ZmMT1融合蛋白大小一致(GST的大小约为26 kDa,ZmMT1大小约为8 kDa)。酶切纯化后ZmMT1在SDS-PAGE(泳道5)中以约18 kDa的表观分子量迁移,但其计算的分子量仅为约8 kDa。这个观察结果与典型植物MT的SDS-PAGE结果完全相同。这主要由于保守的金属——硫醇簇与SDS结合,结果造成其亚化学计量的增加,并因此导致化合物在凝胶中的迁移速率降低[22-24]。

Fig.3 SDS-PAGE of the purified recombinant ZmMT1. Lane M: Protein Marker (kDa). Lane 1: total cell lysate. Lane 2: the supernatant after centrifugation. Lane 3: the sediment after centrifugation. Lane 4: flow-through of the affinity column. Lane 5: the purified ZmMT1 solution. Acrylamide gel concentrations are 15%. 泳道M:蛋白质标记(kDa)。泳道1:总细胞裂解物。 泳道2:离心后的上清液。 泳道3:离心后的沉淀物。 泳道4:穿透液。泳道5:纯化后的ZmMT1溶液。 丙烯酰胺凝胶浓度是15%图3 纯化重组的ZmMT1的SDS-PAGE

2.4 Apo-ZmMT1与不同金属离子的相互作用

本文我们选择了镧系元素中离子半径最小的轻稀土元素La和离子半径最大的重稀土元素Lu,就其在体外条件下与ZmMT1的相互作用进行了探讨。选用不同浓度的Lu3+(1-20 mmol/L)、La3+(1-20 mmol/L)滴定apo-ZmMT1。如图4所示,当La3+(图4A)、Lu3+(图4B)与 apo-ZmMT1的物质的量比从1增加到20时,apo-ZmMT1在215 nm的吸收光谱形状和强度基本上并没有什么变化。鉴于金属离子与硫蛋白的结合具有协同性,我们尝试加入一定浓度(50 μmol/L)的Cd2+离子以便形成一个更有利于金属与硫蛋白结合的配位环境。图4(C、D)是向上述体系中加入一定浓度(50 μmol/L)的Cd2+后用Lu3+、La3+滴定ZmMT1的紫外光谱。图4(C、D)表明:只有Cd-ZmMT1在250 nm处的肩峰,此外再无其它特征吸收峰。所以,即使在Cd2+存在的条件下,也很难证明Lu3+、La3+同apo-ZmMT1能有效地结合,这与黄仲贤等[16]报道的稀土离子(至少是Nd3+离子)在体外不能同大鼠肝金属硫蛋白有效结合相吻合。

A: La3+ titration apo-ZmMT1; B: Lu3+ titration apo-ZmMT1; C: La3+titration Cd2++apo-ZmMT1; D: Lu3+ titration Cd2++apo-ZmMT1(The concentration of ZmMT1 is 15 μmol)Fig.4 (A),(B) UV spectra of the titration of apo-ZmMT11 with La3+and Lu3+ A:La3+滴定apo-ZmMT1; B:Lu3+滴定apo-ZmMT1;C:La3+滴定Cd2++apo-ZmMT1; D:Lu3+滴定Cd2++apo-ZmMT1;ZmMT1的浓度为15μmol图4 不同稀土离子滴定玉米金属硫蛋白(ZmMT1)的紫外光谱变化图

同样浓度条件下,我们进一步探究了生理元素Zn2+以及重金属元素Cd2+与ZmMT1的相互作用,由于MT分子的组成中没有芳香性氨基酸,因此在280 nm波长处没有吸收峰。并且脱金属后的硫蛋白在220 nm以上的波长范围内没有特征吸收峰,只在210 nm左右呈现一个由多肽链n-π*跃迁产生的吸收峰,标志多肽链呈无规卷曲的无序状态[25]。

A: Zn2+ titration apo-ZmMT1; B: Cd2+ titration apo-ZmMT1)(The concentration of ZmMT1 is 15 μmol)Fig.5 UV spectra of the stepwise titration of apo-ZmMT1 with Zn2+、Cd2+ A:Zn2+滴定apo-ZmMT1; B:Cd2+滴定apo-ZmMT1)(ZmMT1的浓度为15 μmol)图5 不同金属离子滴定脱玉米金属硫蛋白(apo-ZmMT1)的紫外光谱变化图

由图5可以看出,Apo-ZmMT1只在215 nm处出现一个由多肽链n-π*跃迁产生的吸收峰,随着金属离子的加入,如图5A所示,对于Zn(Ⅱ)-ZmMT1在230 nm的波长处有一个幅度较广的吸收带,当滴加至0.05 mol/L时,Zn2+-巯基的特征吸收值几乎不再变化。继续延长反应时间和滴加锌离子,吸收光谱值并未发生变化。图5B随着Cd2+/ZmMT1比例的增加,Cd2+-巯基的特征吸收峰在250 nm处明显增强,这主要来源于镉离子与巯基 (Cd-SH) 之间的电荷跃迁。随着镉离子的加入,紫外吸收强度逐渐增加,当达到0.06 mol/L时,紫外吸收强度趋于平衡;继续滴加镉离子,吸收光谱也不再发生变化。结果表明,相对于稀土离子来说,对ZmMT1同样具有诱导表达作用的Zn2+和Cd2+来说,其在体外却能与ZmMT1进行有效的结合。

3 讨论

综上所述,ZmMT1在体内可以很好地耐受Zn2+、Cd2+、La3+、Lu3+,其中稀土离子能够同La3+和Lu3+在体内能够诱导产生金属硫蛋,且诱导表达的程度与生理元素Zn2+和重金属离子Cd2+几乎一致,但是体外研究发现ZmMT1可以与Zn2+以及Cd2+发生特异性结合,却不与稀土离子La3+、Lu3+发生有效结合,对于这种现象我们猜测可能由于:①尽管金属硫蛋白具有重金属解毒功能,但这一功能是以它特殊的结构为基础的。稀土元素为亲氧元素具有亲氧性,而玉米金属硫蛋白为富含半胱氨酸的硫蛋白,富含巯基,根据软硬酸碱理论,含有大量巯基的金属硫蛋白所易于结合并从而进一步起作用的成分,必然是那些较软的、亲硫的金属离子,如Zn、Cd、Hg、Cu、Ag等,因此从理论角度解释二者不具有结合的可能性。②大量文献报道植物金属硫蛋白主要结合“光谱沉默”的d10过渡金属离子,这些离子的最外层电子具有18电子(s2p6d10)的铜型结构,主要集中在元素周期表中的ⅠB、ⅡB和ⅢA-ⅦA的元素,而稀土元素集中在第ⅢB,且不具有18电子(s2p6d10)的铜型结构,因此不满足结合的特性。③虽然玉米金属硫蛋白含谷氨酸、酪氨酸、组氨酸这样的含氧氨基酸,但在玉米金属硫蛋白中的含量太少几乎不能起主导效应,因此二者无法有效结合。

稀土离子与金属硫蛋白的相互作用在体内、体外产生了截然相反的结果,即玉米金属硫蛋白在体内可以耐受稀土离子,并且稀土离子可以诱导玉米金属硫蛋白的表达,且诱导结果呈现明显的“低促高抑”现象,与稀土生物效应相吻合,而在体外却不与其发生特异性结合,我们推测稀土离子作为植物生长调节剂的作用发挥,在体内的靶蛋白与金属硫蛋白之间存在关联,但是作用的方式可能不是简单的结合作用,而是通过其他方式,比如说诱导聚合的方式发挥作用,我们正在进一步研究。