丁媛媛,弓晓娟,刘洋,高艺芳,路雯婧,焦媛,董川*

(1.山西大学 化学化工学院,山西 太原 030006;2.山西大学 环境科学研究所,山西 太原 030006)

0 引言

碳量子点是继富勒烯,碳纳米管以及石墨烯之后出现的一种新型碳纳米材料,是一种尺寸在10 nm以下的碳纳米颗粒[1]。与传统的半导体量子点和有机染料相比,碳量子点具有良好的水溶性和分散性[2]、强光稳定性和化学稳定性[3]、易于表面修饰和功能化[4]及良好的生物相容性和低毒性[5]等优异的特性,使其在生物成像[6]、化学传感[7]、药物递送[8]等方面引起研究者的广泛兴趣。然而,目前报道的碳大多呈现蓝色或绿色荧光,无法避免细胞中生物基质自体荧光的干扰,同时也会对细胞造成一定程度上的光损伤,使其在生物医学方面的应用受到限制[4,9-11]。因此,研制具有长发射波长的碳量子点是迫切需要的。

目前,碳量子点发光机制尚不明确,合成长发射波长的碳量子点具有挑战性[10,12]。一些研究表明[7,13-15],氮掺杂是提高碳量子点发光性能的有效途径。Lin等[16]通过氮元素掺杂的方法合成出红色碳量子点,并提出高的氮元素含量和尺寸效应是影响长波长发射的关键因素;Jiang等[7]制备了氮掺杂的黄色荧光碳量子点并将其应用于细胞成像以及多功能传感;Ding等[10]合成出氮掺杂的红色荧光碳量子点并将其成功用于小鼠的体内成像和体外细胞成像。然而,大多数长波长碳量子点的制备需要经过复杂的柱色谱分离纯化过程。本文以对苯二胺为前驱体,通过简便的一步微波法合成得到高量子产率的橘色荧光碳量子点N-CDs,对其进行表征和相关性能研究,并用于细胞成像分析。研究表明N-CDs具有优良的光学性质和良好的生物相容性,在细胞成像方面具有潜在的应用价值。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

试剂:对苯二胺,氯化钠,磷酸二氢钠,磷酸氢二钠及罗丹明B购自阿拉丁试剂公司,乙二胺和无水乙醇购自天津市福晨化学试剂厂,均为分析纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。

仪器:JEM-2100场发射透射电子显微镜(JEOL,日本电子光学公司);Lambda 365 紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer),CARY-Eclipse 荧光分光光度计(美国VARIAN公司); Tensor-27 红外光谱仪(德国Bruker公司);AXIS ULTRA DLD型 X-射线光电子能谱仪(英国Kratos公司);SunRise型酶标仪(奥地利Tecan Austria GmbH公司);FE20酸度计(瑞士METTLER TOLEDO公司);G70D20CN1P-D2(S0)微波炉(中国Galanz公司)

1.2 N-CDs的合成方法

首先,准确称取0.2 g对苯二胺置于100 mL烧杯中,加入5 mL乙二胺,用玻璃棒充分搅拌直至对苯二胺完全溶解于乙二胺溶液中,将烧杯置于微波炉中,以500 W的功率反应20 min,反应结束后冷却至室温。其次,用孔径为0.2 μm滤膜过滤反应所得到的溶液,并将其置于500～1 000 Da的透析袋透析纯化48 h以去除未反应的小分子原料。最后,将透析所得溶液进一步冷冻干燥,得到浅紫色的絮状粉末。

1.3 荧光量子产率的测定

采用相对量子产率测定的方法[17],以罗丹明B的乙醇溶液作为参比溶液,通过测量碳点稀溶液和罗丹明B稀溶液在同一激发波长下的积分荧光强度和该激发波长下的吸光度值(吸光度均小于 0.1),然后按下列公式计算碳点的荧光量子产率:

其中ø表示所需测试样品的量子产率,I表示测试样品的积分荧光强度,n表示折射率(水溶液中为1.33,乙醇溶液中为1.36),A表示吸光度,带有符号(′)表示所选参比的各个物理量。为得到更准确的测量结果,通过改变罗丹明B和所测碳点的浓度,分别测量一系列浓度下495 nm处的吸光度值(0-0.1)及相应的积分荧光强度。最终通过比较以积分荧光强度和吸光度作为变量的直线的斜率来确定样品的荧光量子产率。

1.4 细胞毒性及细胞成像实验

采用标准MTT法来测量N-CDs对肺腺癌A549细胞的体外细胞毒性。将A549细胞以1×104每孔接种于96孔板中,每孔体积100 μL37℃质量分数5% CO2培养箱中培养24 h后,吸弃培养液。加入含有不同浓度的碳点的培养基继续培养24 h后,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)继续孵育4 h。吸弃培养上清液,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min。酶标仪测定490 nm处的吸光度。

细胞成像实验时,将肺腺癌A549细胞以1×105每孔接种于24孔板中培养24 h后,加入浓度为100 μg/mL的N-CDs溶液,继续孵育4 h后,移除培养上清液,用pH为7.4的PBS缓冲溶液清洗3次后,于荧光显微镜下成像,观察N-CDs进入肺腺癌A549细胞后的成像情况。

2 结果与讨论

2.1 碳量子点的表征及性能研究

以0.2 g对苯二胺以及5 mL乙二胺分别以20%,40%,60%,80%和100%的功率进行五组微波反应,其中每组以5 min,10 min,15 min,20 min为梯度进行反应,得到20种反应物,将反应物冷却至室温,通过荧光光谱仪对反应物的荧光性能进行测定,测得在20%的功率下反应20 min时,荧光性能优异,且产率最高(13%)。通过TEM来表征N-CDs的表面形态和尺寸大小。如图 1A所示,所制备的碳量子点呈现均匀的圆球形,且分散性良好,尺寸大小均一。图 1B是通过测量 100 个碳量子点的粒径,从而得到相应的粒径分布图。由图可知,粒径的分布范围在3.5～6.0 nm,平均粒径约为5.8 nm,整体呈现正态分布。

Fig.1 Morphology and particle size of N-CDs. (A) TEM images; (B) Particle size distribution(A)N-CDs的扫描电镜图;(B)N-CDs的粒径分布图图1 N-CDs的形貌和粒径分布图

Fig.2 Spectrum of N-CDs. (A) PL excitation and emission spectra of N-CDs. The inset displays photographs of the N-CDs under daylight (left) and UV irradiation (right) in aqueous solution.(B)UV-vis absorption spectra of N-CDs.(C) PL spectra of N-CDs at different excitation 400～550 nm. 1:400 nm, 2:420 nm,3:440 nm, 4:460 nm, 5:480 nm, 6:500 nm, 7:520 nm, 8:530 nm, 9:540 nm, 10:550 nm(A) N-CDs的最大激发和发射光谱图。插图为N-CDs的水溶液在日光下(左)和紫外(右)照射下的图像；(B) N-CDs的紫外吸收光谱。(C) N-CDs在不同激发(400-590 nm)下的发射光谱图。 1:400 nm, 2:420 nm, 3:440 nm,4:460 nm, 5:480 nm,6:500 nm, 7:520 nm, 8:530 nm, 9:540 nm, 10:550 nm图2 N-CDs的光谱图

图2为N-CDs的荧光光谱图。如图2A所示,N-CDs的最佳激发波长为535 nm,对应的发射波长为588 nm。N-CDs的水溶液在自然光下呈粉色透明澄清状,而在紫外灯(365 nm) 下呈现明亮的橘色荧光。图2B为N-CDs的紫外吸收光谱图,由图可知,N-CDs在200～600 nm处显示出较宽的吸收,在245 nm处具有较强的特征吸收峰,这应归属于C=C键的π-π*跃迁以及C-N键的n-π跃迁。图2C为N-CDs在不同激发波长下的发射光谱图。由图可知,当激发波长从400 nm变化到550 nm时,N-CDs的发射光谱不会随着激发光谱的改变而移动,具有一定的激发波长独立性,反映出碳量子点表面的激发态的单一性。另外,以罗丹明B作为参比,测得N-CDs的量子产率为13%。

图3(A)为N-CDs的傅里叶红外光谱图,如图所示,3 308 cm-1处有明显的吸收峰,与之对应的是氨基基团中N-H伸缩振动;1 574 cm-1和1 484 cm-1处有明显的吸收峰,对应苯环上C=C的伸缩振动;3 012 cm-1到2 861 cm-1附近宽的吸收峰对应-CH2-的伸缩振动;1 183 cm-1处的吸收峰对应-CO的伸缩振动。为进一步了解N-CDs成分,对其进行元素分析的表征,结果显示,N-CDs由C,O,N,H四种元素构成,其含量分别为43.00%, 20.60%, 28.19%, 6.21%。图3(B)为N-CDs的X射线光电子能谱扫描图(XPS),由图可知,N-CDs由C,H,O,N四种元素构成,与元素分析所得数据相一致。

Fig.3 (A) FTIR spectrum of N-CDs. (B) XPS survey scan of N-CDs图3 (A) N-CDs的红外光谱图；(B) N-CDs的X射线光电子能谱扫描

图4为N-CDs的高分辨率C 1s, N 1s和O 1s的X射线光电子能谱。如图4(A)所示,N-CDs中碳元素主要有-CO-(288.11 eV),-C-N(285.48 eV)和C=C/C-C(284.42 eV)三种存在形式,在红外光谱图中也可找到相对应的吸收,进一步确定N-CDs中所包含的化学基团。图4(B)为N-CDs的N 1s的分峰光谱图,N-CDs中氮元素主要有氨基类(399.57 eV),吡咯类(400.40 eV)和吡啶类(398.58 eV)三种存在形式,进一步证明N-CDs含有丰富的氮元素,我们成功地将氮元素掺杂到了碳量子点上。图4(C)为N-CDs的O 1s的分峰光谱图,氧元素主要有-C-O(330.70 eV)和-C=O(532.00 eV)两种形式。

2.2 碳量子点的稳定性研究

分别考察了N-CDs的离子稳定性,光稳定性,pH稳定性和热稳定性。采用测量N-CDs在一系列不同浓度的(0～1 mol/L)的NaCl溶液中的荧光光谱的方法来研究N-CDs的离子稳定性。研究结果如图5(A)所示,N-CDs在不同浓度的NaCl溶液中荧光强度较稳定,当NaCl溶液浓度最大达到1 mol/L时,荧光强度依然可达到原溶液强度的80%,显示出优良的抗盐能力,具有良好的离子稳定性。正常体液中生理盐的浓度约为0.15 mol/L(质量百分比为0.9%生理盐水),因此,N-CDs完全可用于富含各种生理盐的体液中。通过测量N-CDs溶液在氙灯长达100 min的不断照射下以及在紫外灯长达180 min的照射下其荧光强度的变化来探究N-CDs的光稳定性。结果如图5(B)和图5(C)所示,N-CDs溶液的荧光强度随着氙灯的不断照射呈现出非常微小的下降趋势,其氙灯照射100 min后的荧光强度仍有最初强度的93%;N-CDs溶液在紫外灯的不断照射下,荧光强度变化较小,180 min后的荧光强度为最初强度的91.5%。表明N-CDs具有较强的光稳定性和抗光漂白性。通过检测N-CDs在一系列不同pH值的PBS缓冲溶液中的荧光强度的变化来研究其pH稳定性。结果如图5(D)所示,N-CDs在不同pH值(1 ～ 13)的PBS缓冲溶液中荧光强度呈现出先增强后减弱而后趋于平缓的趋势,pH为3时荧光最强,此后逐渐降低,pH至7时荧光强度不再降低,而后随着pH的增大荧光强度呈现较稳定状态。整体在酸性条件下呈现出较强的荧光。导致这一现象的原因可能是由于在酸性条件下,N-CDs表面氨基,亚氨基等基团上氮原子的孤对电子易与氢离子结合,从而使N-CDs表面能级变宽、刚性结构增强从而引起荧光发射强度的增加[18-19]。为进一步研究N-CDs的热稳定性,对其进行热重分析(TGA),结果如图5(E)所示,在N2保护下,当温度达到263℃时,N-CDs失重4.63%,为结合水的重量;当温度升高到320℃时,N-CDs大部分热解,失重达到86.85%;当温度进一步升高到520℃时,整体失重达98.53%。表明N-CDs具有良好的热稳定性。同时,通过测定N-CDs表面的Zata电位值,得出N-CDs表面的电位值为-8.64 mV,表面显负电。一定的电荷使其在生物环境中既可兼顾粒子间的稳定性,又能尽量保证其在血液循环中的稳定性。

Fig.4 High-resolution XPS C 1s, N 1s, and O 1s spectra of N-CDs.(A) C 1s XPS; (B) N 1s XPS; (C) N 1s XPS(A) N-CDs的C 1s X射线光电子能谱;(B) N-CDs的N 1s X射线光电子能谱;(C) N-CDs的O 1s X射线光电子能谱。图4 N-CDs的高分辨率C 1s, N 1s和O 1s的X射线光电子能谱

Fig.5 Stability detection of N-CDs. (A)Fluorescence intensity of N-CDs at different concentration of NaCl;(B) Fluorescence intensity of N-CDs under continuously irradiated by xenon lamp;(C) Fluorescence intensity of N-CDs under continuously irradiated by UV;(D) Fluorescence intensity of N-CDs under different pH;(E)TGA curves of N-CDs(A) N-CDs在不同盐离子浓度下的荧光发射强度;(B) N-CDs被氙灯持续照射时的荧光发射强度变化;(C)N-CDs被UV灯持续照射时的荧光发射强度变化;(D) N-CDs在不同pH下的荧光发射强度;(E)N-CDs的热重分析图图5 N-CDs的稳定性检测

2.3 碳量子点的细胞毒性和成像研究

采用标准MTT法来测量N-CDs对肺腺癌A549细胞的体外细胞毒性。图 6 为不同浓度的N-CDs溶液(0 ～ 100 μg/mL) 孵育 A549 细胞 24 h 后的实验结果,由图可知,当N-CDs浓度高达 100 μg/mL时,肺腺癌A549 细胞的存活率依然保持在80%以上。结果表明N-CDs具有较低的细胞毒性,这一性质使其在细胞成像,生物标记等方面具有潜在应用。

图7为肺腺癌A549细胞在浓度为100 μg/mL的N-CDs溶液环境下孵育4 h后,通过514 nm激光激发,激光共聚焦扫描显微镜下的成像结果(A为暗场成像结果;B为明场成像结果;C为明暗场叠加成像结果)。如图7A所示,细胞发出橘色荧光,表明N-CDs能轻易透过A549细胞膜,进入细胞内从而呈现出明亮的橙色荧光,说明N-CDs具有良好的细胞膜通透性和生物相容性,在生物成像领域具有潜在的应用价值。

Fig.6 Cytotoxic effects of different concentrations N-CDs on A549 cells图6 不同浓度的N-CDs对A549细胞的毒性实验结果

Fig.7 Confocal fluorescence image of N-CDs under 514 nm laser excitation of A549 cells(A) Dark fieldimage; (B) Bright field image; (C) Merged image of Brightanddark field image(A)暗场图;(B)明场图;(C)明场和暗场叠加图图7 N-CDs在A549细胞中以514 nm激光激发下的共聚焦荧光图像

3 结论

本研究以对苯二胺为前驱体,以氮掺杂的方式,通过简便的一步微波法制备出一种新型橘色荧光碳量子点(N-CDs),制备方法简便易行,无须经过柱色谱分离过程。所获得的碳点具有长波长发射,优异的光学性质,良好的水溶性,光稳定性,生物相容性及低毒性等优点,并将其成功用于肺腺癌A549细胞的荧光成像,为长波发射的荧光碳点应用于细胞成像提供了基础数据。