金银萍，艾军，夏娟，郭靖，朴向民，王英平

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

五味子为五味子科植物五味子（Schisandra chinensis）的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效[1]。五味子果实药效显著，营养价值高。目前，五味子除药用外，在食品、饮料、酒、保健品等行业都被广泛运用，市场需求量逐年增加，五味子的种植面积不断扩大。人工栽培条件下，五味子冬季和夏季修剪是获得高产稳产和优质必不可少的技术环节。据不完全统计，在五味子的1个生长周期中，仅被修剪丢弃的藤茎、叶量与果实产量相当，如何利用茎、叶资源，对扩大五味子资源利用范围，增加农民收入，保障五味子产业的快速健康发展具有重要意义。

研究结果表明，五味子藤茎中含有与果实类似的化学成分，4年生以上茎藤中五味子甲素、五味子乙素含量均高于果实[2～4]。药理实验也表明，五味子藤茎、叶的提取物具有护肝、抗菌、抗氧化等多种功效[5～7]。本试验共收集了19种五味子优秀品系，其中包括鉴定的新品种“嫣红”，考察不同种质资源五味子藤茎中4种木脂素的含量变化，并采用聚类分析法对其品质进行评价，为五味子药材的综合开发利用以及新品种的选育提供理论参考。

1 材料

1.1 试验材料

19种不同五味子种质资源，于2017年3月10日～3月12日采自通化国家农业科技产业园五味子优良种苗示范推广基地，经艾军研究员鉴定为五味子科植物五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.〕的藤茎。

1.2 仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；CPA225D 电子天平（德国 Sartorius公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（功率：500W；工作频率：40kHz，昆山市超声仪器有限公司）；N-1100旋转蒸发仪（日本东京理化有限公司）。

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品（批号分别为：110857、110764、110765）（中国食品药品检定研究所）；五味子醇乙（批号：YY90208，上海源叶生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯）（美国Fisher公司）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm 50mm，流动相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脱程序：0min～1min、48%～50%A，1min～3min 、50%～70%A；3min～4.5min 、70%～95%A，4.5min～6.5min 、95%A，6.5min～7.0 min、95%～48%A，7min～9min 、48%A；柱温：35℃；样品温度：15℃；检测波长：254nm；流速：0.35 mL/min；进样量：1.0；理论板数（N）：五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的N均＞5 000。而且，各成分基线分离良好，分离度＞1.5（见图1）。

图1 高效液相色谱图Fig.1 UPLC chromatogram

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，置于10mL容量瓶中，甲醇超声溶解定容至刻度，摇匀，得质量浓度分别为115.0/mL、64.0/mL、66.0/mL、47.0mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取五味子藤茎药材粉末（过4号筛）2.0g，用滤纸包好，置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇，超声提取3次，每次30min，滤过，合并滤液，减压浓缩至干，加入适量蒸馏水溶解，用石油醚萃取，弃去萃取液，将水层减压浓缩至干，甲醇定容至25mL棕色容量瓶内，摇匀，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品储备液适量，稀释配制成系列浓度梯度的对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进行测定。以色谱峰峰面积为纵坐标Y、对照品浓度为横坐标X（µg/mL）绘制标准曲线。结果表明，五味子醇甲回归方程为Y=11 600X+16 900（R2=0.999 9），11.5µg/mL～115.0µg/mL 范围内线性关系良好；五味子醇乙回归方程为Y=9 150X+7 080（R2=0.999 9），6.6µg/mL～66.0µg/mL范围内线性关系良好；五味子甲素回归方程为Y=11 500X+6 810（R2=0.999 9），4.7µg/mL～47.0µg/mL范围内线性关系良好；五味子乙素回归方程为 Y=8 470X+4 870（R2=0.999 8），6.4µg/mL～64.0µg/mL范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，进样量1.0µL，测定峰面积，计算得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面积RSD分别为0.43%、0.57%、0.83%和0.66%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一五味子藤茎供试品溶液，室温下放置，分别于 0h、2h、4h、6h、8h、10 h 按“2.1”项下色谱条件进行测定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面积RSD分别为1.26%、1.43%、1.74%和1.61%，表明供试品溶液在10 h内稳定性较好。

2.6 重复性试验

分别精密称取同一五味子藤茎样品 6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面积RSD分别为1.27%、1.96%、2.38%、和2.08%，表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的五味子藤茎样品6份，加入混合对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备加样供试品溶液。各成分的加样回收率和RSD分别为五味子醇甲102.22%和1.87%、五味子醇乙98.02%和2.36%、五味子甲素97.67%和2.93%、五味子乙素97.44%和2.85%。

2.8 药材样品含量测定

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定样品。结果表明，不同种质资源五味子藤茎中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量与木脂素合计的变化趋于一致。不同种质资源间五味子藤茎的木脂素类含量存在较大差异，其中五味子醇甲最高达0.752mg/g，最低为0.118mg/g，其他3种木脂素类似。以木脂素的总量为评价指标，品系白果最佳，品系130-9-6次之。见表1。

表1 不同种质资源五味子藤茎中4种木脂素的含量Table 1 Contents of four lignans in the stems of from different germplasm resources（n=3，mg/g）

续表1

2.9 聚类分析

以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素4种活性成分为指标，采用DPS 12.01统计软件对19种不同种质资源的五味子藤茎药材进行系统聚类分析。距离采用欧式距离，聚类方法采用最短距离法。结果显示，19个样本共分为5类，其中130-9-6和白果2个样品聚为第1类，99-8-7聚为第2类，158-11-6聚为第3类，18-10-3聚为第4类，其余14种聚为第5类。见图2。

从表1和图2可知，质量较好的样本聚成了第1类，品系130-9-6和白果均聚在了这一类中，此类中木脂素含量较高，由此可以判断出这两个品系的五味子藤茎质量较好。

图2 聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram of cluster analysis

3 讨论

选择药效成分木脂素含量高的优良品系对于五味子藤茎的品质评价起着至关重要的作用。本试验收集19种不同优良品系的五味子，应用UPLC同时测定了五味子藤茎中4种主要的药效木脂素类成分的含量，并通过聚类分析方法，以期优选出最佳的五味子品系。试验结果表明，五味子藤茎中含有与果实相同的木脂素成分，且不同种质资源间五味子藤茎的木脂素的含量差异显著；聚类分析结果表明，五味子藤茎品系白果和130-9-6的品质较好，含木脂素药效成分含量较高。