姜 秦，杨 宁，袁 瑞，陈京华，王正丽

( 青岛农业大学 海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109 )

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)是我国主要的海水养殖鱼类之一，具有很高的经济价值，在我国北方大面积养殖。但随着集约化养殖的发展，由于养殖密度高、投饵频率增加及水体污染等原因，褐牙鲆感染疾病的几率大大增加，病害问题已成为制约褐牙鲆养殖业健康发展的瓶颈。探讨免疫防治新途径，提高鱼体自身免疫力，是实现褐牙鲆健康养殖的可靠保障。而通过营养调控提高鱼类的免疫力，已被证实是一种行之有效的方法[1]。

大豆异黄酮是来自大豆的主要植物雌激素[2]，是一种具有类雌激素性质的抗营养因子[3]，现有研究显示，在陆生动物中，大豆异黄酮无论在体内还是体外都具有免疫调节作用[4-6]。鱼类中相关研究较少，有研究表明，饲料中添加低含量大豆异黄酮能够促进异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)生长[7]；饲料中添加适量的大豆异黄酮可以增强卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)免疫活性，降低死亡率[8]。但大豆异黄酮对褐牙鲆免疫效应研究相对较少，国内仅见大豆异黄酮对褐牙鲆免疫细胞功能的体外研究[9]。白细胞介素(IL)是由活化的单核——巨噬细胞和淋巴细胞等产生的作用于淋巴细胞、巨噬细胞或者其他细胞的细胞因子[10]，在免疫活动中进行信号传递、联络白细胞群等功能。免疫球蛋白(Ig)是蛋白质的一种，在鱼体受到外界刺激之后，由体内的免疫系统产生[11]。免疫球蛋白的产生机制是在体内接触过曾经对机体具有刺激作用的物质之后，产生一种可以进行抵抗的蛋白质类抗体[12]。干扰素(IFN)由单核吞噬细胞高度分裂分化之后的巨噬细胞产生，通过干扰外来刺激物在体内的分裂分化和结合过程，进而发挥免疫调节作用[13]。热休克蛋白(HSPs)是一种短期内产生但具有高效作用的蛋白质。热休克蛋白的作用机制是与体内免疫系统分泌的淋巴细胞进行联合，一起作用于外来物质，起到免疫预防的功能[14]。本研究分离褐牙鲆头肾巨噬细胞，在体外培养条件下，研究不同质量浓度大豆异黄酮对褐牙鲆4种免疫相关基因相对表达量的影响，探讨大豆异黄酮的免疫作用，以期为大豆异黄酮作为廉价的免疫增强剂提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用褐牙鲆购自日照某养殖场，体质量(250±12) g，健康，活力好。暂养于水循环系统。暂养期间水温17～19 ℃，盐度32～40，溶解氧>8.0 mg/L，每日饱食投喂2次。

1.2 试验方法

1.2.1 头肾巨噬细胞的分离

褐牙鲆头肾巨噬细胞的分离参考文献[15]的方法。在无菌的条件下，剖取褐牙鲆头肾，研磨并通过100目筛绢，将研磨液转移到34%/51% Percoll分离液表层，4 ℃，2200 r/min离心25 min，吸取中间层巨噬细胞，加入吸取量3倍体积的0.15 mol/L磷酸缓冲盐溶液，1200 r/min离心5 min，洗涤2次，加入2% FBS-L-15(双抗1%)重悬细胞。用台盼蓝检测调整细胞密度至2×107个/mL，按600 μL/孔接种到24孔板中，在20 ℃条件下，恒温培养2 h使细胞贴壁备用。

1.2.2 头肾巨噬细胞的培养

头肾巨噬细胞贴壁培养2 h后，用0.15 mol/L磷酸缓冲盐溶液洗去未贴壁细胞，再分别加入大豆异黄酮质量浓度为0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的5%FBS-L-15细胞培养液，且每个梯度设置3个平行，放于20 ℃恒温培养箱培养，分别在培养后6、12、24 h收集细胞，提取RNA。

添加脂多糖刺激时，吸弃未贴壁的细胞及培养液，分别加入大豆异黄酮质量浓度为0、1.0 mg/mL的5%FBS-L-15细胞培养液，并加入脂多糖使其终质量浓度为100 ng/mL，刺激1 h后，更换为不含脂多糖的大豆异黄酮细胞培养液，培养方法同上，分别在不含脂多糖的培养液中培养3、6、12、24 h后收集细胞，提取RNA。

1.2.3 荧光定量PCR测定

吸弃培养液，收集贴壁细胞，然后采用Trizol法提取细胞RNA，按照康为世纪HiFiScript反转录试剂盒要求合成第一链cDNA，以此为模板进行荧光定量PCR。以-actin为内参基因，RT-PCR反应体系及过程参照Takara PrimeScript荧光定量试剂盒。引物序列见表1。

1.2.4 数据分析

试验所得Ct值采用2-ΔΔCt法计算各基因在不同质量浓度大豆异黄酮培养下的相对表达量。试验结果用平均值±标准差表示，所有数据用SPSS 19.0软件进行分析，两组数据间比较采用t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析，并进行Duncan多重比较，P<0.05表示差异显著。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 大豆异黄酮体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞IL-1相对表达量的影响

研究结果显示，大豆异黄酮在体外能够显著促进褐牙鲆头肾巨噬细胞的IL-1基因相对表达(P<0.05)，且促进作用随着培养时间的延长而增强(图1)。用添加大豆异黄酮的培养液培养6 h后，0.5、1.0、1.5 mg/mL质量浓度组的IL-1基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)；培养12 h后，添加大豆异黄酮试验组的IL-1基因相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)，且1.0、1.5 mg/mL试验组显著高于其他大豆异黄酮添加组；至24 h，大豆异黄酮质量浓度不低于0.5 mg/mL各试验组IL-1的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，且1、1.5 mg/mL试验组的IL-1基因相对表达量最高。即在试验梯度范围内，培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.5～1.5 mg/mL时，能够显著增强IL-1基因的相对表达量。

2.2 大豆异黄酮体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞IFN-相对表达量的影响

图1 大豆异黄酮对褐牙鲆头肾巨噬细胞IL-1的影响不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同.

图2 大豆异黄酮对褐牙鲆头肾巨噬细胞IFN-的影响

2.3 大豆异黄酮体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞IgM相对表达量的影响

离体条件下大豆异黄酮能够显著增强褐牙鲆头肾巨噬细胞IgM基因相对表达(P<0.05)(图3)。培养6 h后，培养液中添加0.5、1.0 mg/mL大豆异黄酮试验组的IgM基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)；培养12 h后，大豆异黄酮为1.0、1.5 mg/mL试验组的IgM基因相对表达量显著高于对照组及其他各组(P<0.05)；至24 h后，0.5、1.0 mg/mL大豆异黄酮试验组的褐牙鲆IgM基因相对表达量显著高于对照组和其他各组(P<0.05)。即在试验梯度范围内，培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.5～1.0 mg/mL时，在体外能够显著增强褐牙鲆头肾巨噬细胞IgM基因的相对表达量。

图3 大豆异黄酮对褐牙鲆头肾巨噬细胞IgM的影响

2.4 大豆异黄酮体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞HSP70相对表达量的影响

离体条件下，培养液中大豆异黄酮能够显著增强褐牙鲆头肾巨噬细胞HSP70基因相对表达(P<0.05)(图4)。培养6 h和12 h后，大豆异黄酮质量浓度为0.5 mg/mL及以上试验组褐牙鲆头肾巨噬细胞中HSP70基因的相对表达显著高于对照组(P<0.05)；至24 h后，大豆异黄酮质量浓度为0.5、1.0、1.5 mg/mL的试验组HSP70的相对表达量显著高于对照组和其他各添加组(P<0.05)。即在试验梯度范围内，体外培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.5～1.5 mg/mL时，能够显著增强头肾巨噬细胞HSP70基因的相对表达量。

图4 大豆异黄酮对褐牙鲆头肾巨噬细胞HSP70的影响

2.5 脂多糖刺激下大豆异黄酮离体对褐牙鲆头肾巨噬细胞免疫相关基因的影响

研究结果显示，在脂多糖刺激后，添加1.0 mg/mL大豆异黄酮培养的褐牙鲆头肾巨噬细胞4种免疫相关基因随刺激后培养时间的变化趋势与未添加大豆异黄酮组基本一致，但是在某些时间点，其相对表达量显著增加。在脂多糖刺激后继续培养6、24 h时，大豆异黄酮添加组的褐牙鲆头肾巨噬细胞的IL-1基因表达量显著高于对照组(P<0.01)；脂多糖刺激后继续培养24 h时，大豆异黄酮添加组IFN-基因的表达量显著高于对照组(P<0.05)；IgM基因则在6 h时显著高于对照组(P<0.01)；而大豆异黄酮添加组的HSP70基因自脂多糖刺激继续培养3 h开始，其相对表达量均显著高于对照组(P<0.01)。

3 讨 论

褐牙鲆的头肾巨噬细胞是固有免疫的效应细胞，在机体免疫防御过程中起重要作用。IL-1、IFN-、IgM和HSP70是4种比较典型的免疫相关基因，均在褐牙鲆头肾巨噬细胞中表达，因此本试验选择离体条件下用不同质量浓度大豆异黄酮培养褐牙鲆头肾巨噬细胞，在不同时间测定上述4种基因的相对表达量，以此探讨大豆异黄酮与免疫的相关性。研究结果显示，大豆异黄酮能够显著影响这4种基因的相对表达，且不同基因在大豆异黄酮不同质量浓度、不同作用时间均存在显著差异。

脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的成分之一，具有很强的免疫原性，可以调控细胞的信号通路，影响相关基因的表达[20]。李胜亮等[21]研究显示，脂多糖刺激可以导致巨噬细胞IL-1释放增多；于东云等[22]研究显示，HSP70在脂多糖诱导的肺泡上皮细胞中应激表达，认为HSP70对肺损伤起保护作用。本研究在脂多糖刺激条件下，比较研究含1.0 mg/mL大豆异黄酮组与不含大豆异黄酮的对照组的免疫基因表达特点，结果发现，脂多糖刺激后，4种基因表达随时间变化而变化，而添加质量浓度为1.0 mg/mL大豆异黄酮组与对照组的变化趋势基本一致。但是试验组IL-1基因表达在6 h和24 h显著高于对照组；IFN-基因在24 h显著高于对照组；IgM基因在6 h显著高于对照组；而HSP70基因自3 h开始均显著高于对照组。这些变化表明，在受到免疫刺激的情况下，大豆异黄酮可以提高IL-1、IFN-、IgM和HSP70基因的相对表达量，可能提高机体免疫力。

综上所述，在本试验条件下，培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.5～1.5 mg/mL时，能够显著上调体外培养条件下褐牙鲆头肾巨噬细胞IL-1、IFN-、IgM和HSP70基因的相对表达，从而增强褐牙鲆头肾巨噬细胞的免疫力。