王艳艳 孙晓萱 张缪佳 王嫱（通讯作者）

（南京医科大学第一附属医院风湿免疫科 江苏 南京 210029）

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种慢性炎症性疾病，炎症细胞因子尤其是TNF-α在促发和维持RA的炎症反应中扮演决定性角色。RA患者关节内，TNF-α可通过自分泌和旁分泌途径与靶组织上特异性受体结合，经不同信号转导途径激活多种组织和炎性细胞，产生和分泌多种炎症因子、黏附分子、生长因子、金属蛋白酶、胶原酶等招募炎症细胞的聚集和浸润，促进滑膜血管增生、软骨及骨损害[1]。对于RA的早期治疗至关重要，抗TNF-α治疗时机的选择目前仍说法不一，本研究拟通过观察胶原诱导关节炎模型（CIA）不同病程血清及关节局部TNF-α水平表达的变化，为TNF-α抑制剂使用最佳时机寻求依据。

1.材料与方法

1.1 材料

实验动物：Wistar大鼠，雄性，4～6周龄，30只，体重150±20g。主要试剂：牛源性Ⅱ型胶原蛋白及不完全弗氏佐剂，美国chondrex公司产品；过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体（chemicon公司）；札喷酸葡胺注射液(Gd-DTPA0.05mmol/ml)购自广州先灵公司。主要仪器：足趾容积测量YLS-7B。

1.2 模型制备[2]

Wistar大鼠适应性饲养7d后，随机分为两组：实验组15只，对照组15只。分别于第0d，7d以0.5mlⅡ型胶原乳剂（终浓度为1mg/ml），分3点真皮内注射，对照组同部位注射0.05mol/L醋酸溶液0.5ml。

1.3 大鼠血清中TNF-α水平的检测

在免疫大鼠第14d、21d以及42d，随机抽取实验组和对照组各5只，眼眶静脉丛采血分离血清，-200C冻存，用ELISA方法检测血清TNF-α水平。

1.4 大鼠关节组织病理学检查及评分

第14d、21d以及42d，随机抽取实验组及对照组各5只大鼠，光镜下观察组织病理改变，同时进行关节病理评分。免疫组织化学方法染色双足标本，分析TNF-α表达（阳性密度）。

1.5 统计学方法

所有数据用SPSS17.0统计软件处理，正态分布且方差齐同的定量资料以均数±标准差表示，偏态分布资料以中位数表示，两组间均数比较采用t检验或秩和检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 CIA模型

根据关节炎指数评分及左足爪容积测定，大鼠血清抗Ⅱ型胶原抗体水平测定以及大鼠关节病理，CIA成模率93.33%。

2.2 CIA大鼠血清TNF-α水平

21d、42d大鼠血清TNF-α水平明显增高（图1）。

图1 不同病程CIA大鼠血清中TNF-α表达水平

2.3 CIA大鼠关节组织病理学评分

在滑膜增生病理评分上21d和42d的大鼠与14d比较有差异（P＜0.05）；在新生血管病理评分上14d和42d的大鼠与21d比较有差异（P＜0.05）；炎症细胞病理评分上14d、21d和42d无差异。（表1）

表1 不同病程CIA大鼠关节组织病理学评分

2.4 不同病程CIA大鼠关节TNF-a表达

在光镜下观察CIA大鼠14d关节滑膜表面衬里层细胞、软骨细胞及皮肤鳞状上皮细胞，TNF-α呈弥漫弱阳性；21d关节滑膜表面衬里层细胞、软骨细胞、滑膜炎症细胞、血管及皮肤鳞状上皮细胞，TNF-α呈弥漫强阳性；42d关节软骨细胞、滑膜炎症细胞，TNF-α呈弥漫弱阳性。Metamorph图像分析系统，随机5个高倍视野，计算阳性面积比（阳性密度）。21d与14d、42d的关节局部TNF-α表达有显著差异（P＜0.05）。（图2A-C）

图2 A 14d大鼠滑膜衬里层细胞TNF-α弥漫弱阳性

图2 B 21d大鼠滑膜衬里层细胞、浸润炎症细胞、血管壁、软骨TNF-α弥漫强阳性

图2 C 42d大鼠滑膜衬里层细胞TNF-α弥漫弱阳性

3.讨论

TNF-α在RA发病机制中的意义：（1）可以诱导内皮细胞表达黏附分子1，促进白细胞与血管内皮黏附渗透导致局部炎症；（2）增加滑膜、内皮细胞和成纤维细胞释放生长因子促使血管翳的形成刺激基质金属蛋白酶表达；（3）刺激纤维母细胞和软骨细胞产生地诺前列酮，促进软骨损害和胶原降解。研究表明[3][4]多数RA患者血清中、关节液中TNF-α水平升高，TNF-α水平与RF、ESR和CRP呈正相关，与IFN-γ、IL-6变化趋势一致。TNF-α在RA炎症的形成、血管翳增生、软骨和骨破坏中发挥重要病理作用，通过NF-κB途径进一步活化细胞、体液免疫，促进趋化因子、细胞因子、粘附分子表达，形成自身炎症反应环，从而放大炎症反应，导致关节破坏。

本实验通过病理观察到CIA模型受累关节滑膜有大量炎性细胞浸润，在大鼠关节组织炎症炎症细胞病理评分上14d、21d和42d无差异，表明免疫初期直至成模炎症反应持续活跃状态。21d血清中即可检测到高水平TNF-α，免疫42d仍持续高浓度。CIA大鼠滑膜免疫组化染色结果显示TNF-a阳性表达在14d时开始明显增高，21d最强。局部滑膜表达TNF-α早于血清中TNF-α，考虑TNF-α主要是由滑膜巨噬细胞产生，初始主要存在于滑膜衬里细胞层[4]。TNF-α在不同病理时期高表达的部位不同，提示其对于RA的发病机制可能存在不同。

本实验结合CIA模型不同病程的病理学改变，发现CIA大鼠早期出现血清TNF-α水平增高及关节TNF-α表达阳性，且血清TNF-α持续高水平，在滑膜炎、血管翳增生等急性病理损伤期免疫组化TNF-α表达强阳性。基于抗TNF-α能减少RA患者滑膜TNF-α、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1、IL-1β、血管内皮生长因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达，能减少白细胞向炎症关节迁移，减少或阻止关节滑膜炎的发展和骨关节的破坏，改善关节炎症状，结合本实验结果，在RA炎症反应初期，疾病早期使用TNF-α抑制剂可能疗效更佳。