胡 波，于佳妮，张慧方，刘乃刚，郭长青

(1.北京水利医院，北京 100036； 2.广东省中医院，广东 广州 510120； 3.中日友好医院，北京 100029； 4.北京中医药大学，北京 100029)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是造成慢性疼痛和残疾的主要疾病之一，是现代社会一项主要的公共健康问题。膝骨关节炎患者人数众多，且随着我国老龄化的不断加剧，其人数不断增加。一项来自中国健康与养老追踪调查(China Health and Retirement Longitudinal Study, CHARLS)的数据统计结果显示[1]，在全国范围内的17 128例抽检个体中(45岁以上，平均年龄59.8岁)，症状性膝骨关节炎的患病率为8.1%，女性(10.3%)多于男性(5.7%)，结合第6次全国人口普查数据，我国45岁以上人口约为4.43亿，可以推算出我国症状性膝骨关节炎的病人数量约为3 590万，膝骨关节炎的防治形势面临着严峻的挑战。膝骨关节炎主要表现为膝关节疼痛和功能障碍，而股四头肌肌力减弱是造成膝关节疼痛和功能障碍的重要因素[2-4]，对膝骨关节炎的发病和病情进展都有重要的影响。研究显示[5-6]，正常的肌肉功能在关节运动、应力吸收及平衡、本体感觉和关节稳定等方面均发挥重要的作用，从而保护关节、延长关节使用寿命。目前，对于膝骨关节炎的治疗，提高膝关节相关肌肉功能是一项重要措施[7]。针刀疗法是一种中医原创疗法，主要作用于肌肉、韧带等软组织[8]，研究表明:[9-10]针刀治疗后患者疼痛、功能障碍等症状明显减轻，但针刀治疗是否能影响股四头肌肌力尚未有研究。因此，本研究通过对关节软骨HE染色及Mankin评分、股四头肌收缩性能的观察，探讨针刀治疗KOA的作用机理。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级6月龄新西兰大白兔28只，购自北京金牧羊实验动物养殖有限责任公司[许可证号：SCXK京2015-0005]，体质量(2.5±0.54)kg，单笼饲养，自由摄食、饮水，自然光线照射，室温(22±2)℃，湿度40%～60%，实验室定期紫外线消毒。

1.2 实验材料及仪器

固宝牌树脂绷带(珠海丽珠医用生物材料有限公司，规格：15 cm×180 cm)；高分子树脂绷带(苏州可耐特医疗科技有限公司，规格：7.5 cm×360 cm)；汉章系列一次性针刀(北京卓越华友医疗器械有限公司，规格：0.4 mm×40 mm)；中研太和牌一次性针灸针(北京中研太和医药有限公司，规格：0.25 mm×25 mm)；HANS穴位神经刺激仪(北京华为产业开发公司，LH202H型)；分体式包埋机(德国莱卡，EG1150)；半自动轮转式切片机(德国莱卡，RM2245)；自动化智能型正置研究级显微镜(日本奥林巴斯，BX53)；四道生理记录仪(成都仪器厂，RM-6240)；肌肉张力换能器(成都仪器厂，JH-2204005，50 g)。

1.3 实验试剂

肌肉缓冲液(1 000 mL台氏液含：NaCl 8.0 g、10% KCl 2.0 mL、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL、5% NaH2PO4·2 H2O 1.3 mL、NaHCO31.0 g、1M CaCl21.8 mL、葡萄糖1.0 g，超纯水定容至1 000 mL)；4%多聚甲醛(北京化学试剂公司)；酒精(北京民生药业有限公司)；1%盐酸(北京华夏蓝筹生物科技有限公司)；二甲苯(北京北化化学品有限责任公司)；石蜡(北京化学试剂公司)；伊红y(北京伊诺凯科技有限公司)；苏木素(北京百诺威生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型制备

采用改良后Videman左后肢伸直位固定制动法复制KOA模型：造模前禁食10～16 h，耳缘静脉注3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)法进行麻醉，麻醉后，仰卧固定于操作台上，先用65℃～85℃热水浸泡树脂绷带使其软化，然后牵拉兔左后肢使其处于伸直位，以树脂绷带从腹股沟到足趾固定动物左下肢(膝关节伸直180°，踝关节背屈60°)，并在树脂绷带内侧垫一层脱脂棉，随后用医用纱布将树脂绷带固定好后，再外裹2层高分子树脂绷带，待定型后外套丝袜以防动物撕咬，剪开丝袜末端留出足趾观察血供、肿胀等情况。共制动5周，每组随机选取1只模型兔处死，取关节软骨做形态学观察，示造模成功后，拆除制动材料。

2.2 分组及处理

采用随机数字表法将实验动物分为正常组、模型组、针刀组和电针组4组，每组各7只，其中1只用于造模后形态学观察造模是否成功。实验过程遵循中华人民共和国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导意见》。除正常组外，其余各组动物均采用改良后Videman左后肢伸直位固定制动法复制KOA模型。

2.3 干预措施

正常组：正常饲养，不做干预治疗。

模型组：造模后正常饲养，不做干预治疗。

针刀组：拆除制动材料1周后，按照针刀四步进针规程操作，2次/周，共治疗4周。具体选点及操作：①股内、外侧肌腱止点进针点操作：分别松解股内、外侧肌肌腱延续处，针刀刀刃平行于肌腱，刀体与皮肤切面垂直刺入，向肌腱与骨连接方向进行松解3～5针;②股直肌肌腱止点：针刀刀刃平行于肌腱，刀体与皮肤切面垂直刺入，向肌腱与骨连接方向进行松解3～5针;③股二头肌肌腱止点：针刀刀刃平行于肌腱，刀体与皮肤切面垂直刺入，向肌腱与骨连接方向进行松解3～5针;④条索结节点：在膝关节周围进行循按触摸，如有明显的条索和结节，则作为治疗点,针刀刀刃平行于条索结节，刀体与皮肤切面垂直刺入，向条索和结节的纵轴方向进行上下松解3～5针。

电针组：拆除制动材料1周后，进行电针治疗，3次/周，共治疗4周。选穴：梁丘、血海、内膝眼和外膝眼，均取左侧穴位，梁丘、血海直刺0.8～1.2 cm，内膝眼、外膝眼向髌骨方向斜刺0.5～0.8 cm，以HANS穴位神经刺激仪分别连接梁丘与血海、内膝眼与外膝眼(疏密波，2/100 Hz，3 mA)，留针20 min。

2.4 指标检测与方法

2.4.1 软骨HE染色 治疗结束1周后，采用麻醉过量法处死动物后进行取材，打开膝关节腔，切断膝关节周围韧带及其他软组织，切掉半月板,暴露股骨远端软骨，以咬骨钳快速取下股骨内侧髁1 cm×1 cm的软骨-骨标本，以生理盐水冲洗组织块上的血液、黏液及污物等，浸入4%多聚甲醛溶液中固定72 h。将软骨-骨标本放入EDTA脱钙液进行脱钙处理，脱水、透明、透蜡后进行石蜡包埋，切片6 μm，苏木素-伊红染色，每组选取4个样本对兔膝关节软骨情况进行光镜观察，采用盲法让评分人员对软骨HE染色光镜片按照Mankin法[11]进行评分。

2.4.2 股四头肌收缩力学检测 治疗结束1周后，取材前进行股四头肌收缩力学实验，检测前动物禁食12 h，耳缘静脉注射麻醉(3%戊巴比妥钠,30 mg/kg)。麻醉后，将实验动物仰卧固定于兔台,在髌骨下方剪开皮肤，沿肢体纵轴向上剪开皮肤直到大腿根部，继续向上剪开皮肤3～4 cm，小心剥离皮肤、筋膜,暴露肌层。切断髌韧带，小心分离股四头肌至髂骨连接处，保持股四头肌与髂骨处于连接状态。将手术缝合线结扎于髌骨与股四头肌的肌腱连接处，牵拉肌肉到自然状态下的长度后连接于张力换能器，保持肌肉上结扎线、肌肉走行、张力换能器上的结扎线在一条直线上。

将张力换能器固定于支架上，将换能器上的信号采集线连接于MR-6240生物信号采集系统处理器。刺激电极平行扎入股四头肌肌腹，避免电极相互接触。启动示波按钮，调节张力换能器在支架上的位置使基线维持在-2后归零。选择刺激器的刺激参数，波宽5 ms，延时10 s，先采用单刺激，刺激强度从零开始逐渐微调递增，每次增加0.1 v的刺激强度，观察肌肉收缩曲线变化及收缩幅度，直至找到股四头肌单收缩的最大收缩幅度(Pt)，并记录。利用引起肌肉单收缩的最大刺激幅度的60%为基线给予肌肉连续刺激，逐渐加大刺激幅度，观察肌肉收缩曲线变化，直到找到股四头肌强直收缩的最大收缩幅度(Pt)并记录。在肌肉每次收缩后，都给予肌肉30 s的休息时间，并不断滴加肌肉缓冲液。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组兔软骨HE光镜观察结果比较

正常组兔膝关节软骨结构完整，由浅入深可见表浅层、移行层、辐射层和钙化层，四层结构清晰可辨。表浅层软骨细胞较小，呈扁平状，其长轴与软骨表面平行，单个分布;移行层细胞呈圆形, 大小差别不大, 排列无规律，细胞分裂增生形成同源群;辐射层多个细胞呈柱状排列, 与软骨表面垂直，细胞间质较多,潮线清晰完整,无软骨细胞簇集现象，无血管翳生成。

模型组兔膝关节软骨层次紊乱，四层结构分辨不清，表层和移形层软骨分层剥脱，部分区域剥脱至辐射层，表层和移形层软骨细胞弥漫性增生，细胞簇集现象严重(如封三彩图1中箭头所指)，潮线消失，放射层可见少量软骨细胞呈柱状排列。

电针组兔软骨结构尚清晰，软骨表面不规则，软骨细胞蔟集现象严重(如封三彩图1中箭头所指)，但仍可见到辐射层软骨细胞柱状排列，潮线模糊不清，未见血管翳生成。

针刀组兔膝关节软骨结构较清晰，可见表层、移行层、辐射层和钙化层，软骨表面欠光滑，软骨细胞排列稍紊乱，软骨表层、移行层局部可见软骨细胞簇集现象(如封三彩图1中箭头所指)，辐射层软骨细胞仍呈柱状排列，排列较规则，与软骨表面垂直，细胞分裂成同源群，潮线较模糊，未见血管翳生成。见封三彩图1。

3.2 各组兔软骨HE染色光镜Mankin评分比较

造模组后，模型组兔软骨HE染色光镜Mankin评分较正常组明显升高(P<0.01)。电针、针刀干预后，两组兔软骨HE染色光镜Mankin评分较模型组显著降低(P<0.01)，针刀组兔软骨HE染色光镜Mankin评分较电针组显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组兔软骨HE染色光镜Mankin评分比较

注：与正常组比较,**P<0.01；与模型组比较,##P<0.01；与电针组比较,▲P<0.05

3.3 各组兔股四头肌收缩力学结果比较

造模后，模型组兔在股四头肌单收缩幅度和强直收缩幅度上较正常组均显著降低(P<0.05或P<0.01)。干预治疗后，电针组兔在股四头肌单收缩幅度和强直收缩幅度上较模型组无显著差异(P>0.05)，针刀组兔在股四头肌单收缩幅度和强直收缩幅度上较模型组显著升高(P<0.05或P<0.01)，较电针组显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组兔股四头肌收缩力学结果比较

注：与正常组比较,*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较,#P<0.05，##P<0.01；与电针组比较,▲P<0.05

4 讨论

KOA是一种与年龄相关的退行性疾病，性别、体重、内分泌代谢及生物力学等诸多因素都能影响KOA的进展，其中生物力学因素起到至关重要的作用。正常的膝关节活动需要骨、韧带等提供静力性稳定，而肌肉提供动力性稳定，正常的肌肉功能可维持膝关节的良性应力分布，从而维持正常膝关节软骨合成分解代谢平衡[12]。在膝骨关节炎患者，肌肉功能下降，尤其是股四头肌肌力下降是引发膝关节应力失衡的主要诱因之一，进而造成KAO的发生和加重[13-14]。

研究发现[15]:膝关节周围的肌肉只在紧张状态下加载，对膝关节起到支持作用。也就是说，肌肉主动收缩功能越强，对膝关节的支持作用越大，膝关节越稳定。根据肌骨生物力学的理论，在正常情况下，骨骼肌的收缩形式包括单收缩和强直收缩两种方式。肌肉接受支配它的运动神经发出的一次刺激后产生的机械性反应，称单收缩。单收缩是能记录到的肌肉活动的基本单位。当给予肌肉刺激的频率越高时，肌肉收缩频率越快，肌肉产生的张力越大。当肌肉的收缩融合并维持在最大张力时，肌肉发生强直收缩，而强直收缩是骨骼肌能产生流畅运动的重要机制，骨骼肌功能主要以强直收缩的方式来完成。因此，测定骨骼肌的单收缩和强直收缩最大幅度是分析判断肌肉的收缩功能的重要指标。

本实验结果显示：造模后，模型组兔膝关节软骨HE染色显示软骨结构紊乱、破坏，Mankin评分较正常明显升高(P<0.01)，股四头肌单收缩幅度和强直收缩幅度较正常均显著降低(P<0.05，P<0.01)，说明造模后，关节软骨出现退变，股四头肌肌力出现下降。电针、针刀干预后，电针组兔膝关节软骨HE染色较模型组有所改善，Mankin评分较模型组显著降低(P<0.01)，股四头肌单收缩幅度和强直收缩幅度较模型组无显著差异(P>0.05)；针刀组兔膝关节软骨HE染色较模型组改善明显，Mankin评分较模型组显著降低(P<0.01)，股四头肌单收缩幅度和强直收缩幅度上较模型组显著升高(P<0.05或P<0.01)，且与电针组相比，Mankin评分显著降低(P<0.05),股四头肌单收缩幅度和强直收缩幅度上显著升高(P<0.05)。说明电针和针刀干预均可以改善KOA模型兔关节软骨的退变，并改善股四头肌肌力，且针刀干预要明显优于电针干预。

针灸疗法是我国的传统医疗技术，是治疗KOA的有效方法之一[16]，并且已被全世界认可和接受，成为多个国际KOA临床指南的推荐疗法。针刀疗法源于针灸疗法，同时又融合了外科手术学的某些技巧，形成了一种独具特色的临床治疗方法，在肌肉骨骼系统疾病方面较传统针灸疗法有明显的优势[17]。笔者前期的临床研究[18]显示电针、针刀治疗可以改善患者的膝周软组织张力，且针刀治疗优于电针治疗。多个相关临床研究[19-21]也有显示针刀对于膝骨关节炎有较好的临床效果。本实验通过关节软骨HE染色及Mankin评分、活体肌肉收缩性能检测表明，针刀干预可以改善模型兔关节软骨的退变，促进关节软骨修复，同时可提高股四头肌的收缩性能，提高股四头肌肌力，且各项指标均优于电针干预,与临床研究结果相符。针刀干预可以提高股四头肌的收缩性能是其治疗KOA的重要机制之一。