宋志伟，陈露露，潘宇，钟子楠，王晶

黑龙江科技大学环境与化工学院，黑龙江 哈尔滨 150022

秸秆有效处理及资源化是目前备受关注的环境问题，微生物菌剂降解秸秆是近年来研究较多的秸秆生物处理方法（Zhang et al.，2018）。微生物菌剂处理秸秆是根据秸秆的性质和结构选取适宜的微生物菌种，分解秸秆中的有机质和纤维结构，使之转化为CO2、水、矿物质及热量。目前，微生物菌剂处理秸秆通常采用与畜禽粪便或化肥配合，进行高温堆肥和还田处理，也用于沼气发酵的预处理，这些处理方法尚存在着一定的局限性。畜禽粪便本身即是宝贵的生物肥料，高温堆肥受环境条件影响大，易有恶臭产生，对环境造成污染；与简单的秸秆还田相比，施加化肥减少了土壤中固氮菌、放线菌等有益菌的数量；适用于沼气发酵的复合微生物菌种正处于研究探索阶段（钱海燕等，2012；张瑞，2014；鲍士旦等，2000）。

本文选取了EM、VT1000、强兴3种商品菌剂，将其直接作用于粉碎成末并与果皮蔬菜混合垃圾按不同配比混合的秸秆物料，无需发酵。通过分析微生物菌剂处理后物料理化性质、半纤维素降解率和微生物种群结构的变化，探讨不同微生物菌剂和原料配比对物料理化性能和降解性能的影响，以期寻求一种秸秆快速高效降解的途径。

1 实验材料与方法

1.1 实验原料

（1）水稻秸秆：取自黑龙江科技大学周边农村，风干后剪切成2.0 cm左右的小段，再用粉碎机将秸秆粉碎过筛至1 mm以下，备用。

（2）果皮、菜叶混合垃圾：取自黑龙江科技大学周边市场，于65 ℃烘干箱中风干至恒重后粉碎过筛至1 mm以下，备用。

将粉碎至 1 mm以下的水稻秸秆和果皮蔬菜按质量比分别为 3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5、3∶6的比例充分混匀，备用。供试原料的理化性质见表1。

1.2 促腐剂

（1）EM菌剂（商品名）：云酵生物科技有限公司生产，其中主要包括芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、木霉菌等多种有益微生物，有效活菌数达2000亿/克。

（2）VT1000菌剂（商品名）：北京沃土天地生物科技股份有限公司生产，主要成分有乳酸菌、芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、霉菌等，菌落密度（CFU）为 2108 ind·mL-1。

（3）强兴菌剂（商品名）：北海强兴生物科技有限公司生产，主要成分有细菌、真菌、酵母菌等多种有效物质。

1.3 实验设计

（1）反应容器：自制，材质为PP（聚丙烯），长×宽×高=17 cm×11.7 cm×5.6 cm，体积750 mL，透明方型加厚型塑料保鲜盒；于保鲜盒底部和顶部的中间位置等距开孔52个，小孔直径约1～2 mm；保鲜盒较长两侧各开孔40个。

（2）水稻秸秆处理：共进行4组试验，分别选取市面上应用较多的EM、VT1000、强兴3种商品菌剂作为促腐剂，按菌剂用量说明书要求等比例换算加入菌剂，以未加菌剂处理作为空白对照。

向不同配比的混合物料中添加微生物菌剂充分混匀后，加水调节含水率为 60%（手握物料液体渗出但不成滴），置于自制的反应器中进行堆腐处理，每组试验均设置3个平行。测试取样时在每个平行样中各取 1/3后物料混合均匀后进行测定，试验周期为45 d。分别于第0天和第45天取样测定物料的全碳、全氮、速效钾、速效磷和半纤维素含量；试验周期结束后测定物料中微生物种群结构。

1.4 项目分析及方法

（1）理化性质分析：采用总有机碳分析仪测定全碳含量；凯氏定氮法测定全氮含量；浸提火焰光度法测定速效钾含量；，0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定速效磷含量（潘晓辉，2007）。

（2）降解率分析：半纤维素测定采用差重法（张蓓，2012）。准确称取粉碎后的样品1.000 g，置于250 mL三角瓶中，加入2 mol·L-1盐酸70 mL，然后放入已沸的高压锅中，100 ℃保温50 min，过滤至中性（滤液由浅黄色变为无色透明），依次用体积分数为95%的乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次，将残渣置于 80 ℃烘箱中烘干至恒重，记录质量W1，1.000-W1即为半纤维素含量。

（3）微生物种群构成分析：采用高通量测序技术，测序实验流程如图1所示。

2 结果与分析

2.1 3种菌剂对物料理化性质的影响

2.1.1 对全碳的影响

由表2可知，EM处理的物料全碳含量最低的为物料配比3∶2，其全碳含量为8.19%；VT1000处理的全碳含量最低的为物料配比 3∶5，全碳含量为9.11%；强兴菌剂处理的全碳含量最低的为物料配比3∶5，全碳含量为10.25%。3种菌剂作用于不同配比原料，其全碳含量的变化无明显规律，全碳含量变化幅度由高到低顺序依次为EM菌剂、VT1000菌剂、强兴菌剂，说明EM菌剂降解秸秆中有机质的能力最强，其次是VT1000菌剂。EM菌剂在物料配比为3：2时对物料中有机质的降解效果最好。

表2 不同菌剂处理后物料全碳含量Table 2 Total carbon content of the material treated by different microbial agents %

表1 供试原料的基本理化性质Table1 Basic properties of the materials tested

图1 高通量测序实验流程Fig. 1 Process of high-throughput sequencing

2.1.2 对全氮的影响

由图2可知，加菌剂的3组物料全氮下降幅度较无菌剂组更高，说明菌剂中微生物对物料全氮消耗具有一定的促进作用。其中，VT1000处理后物料全氮下降幅度较高的是物料配比为3∶1和3∶2的处理，分别为55.24%和55.02%；EM 处理后物料全氮下降幅度最高的是物料配比为3∶2的处理，下降幅度为 54.75%；强兴菌剂处理后全氮下降幅度最高的是配比为3∶2的处理，下降幅度为45.21%。分析可知，不同菌剂处理后物料的全氮下降幅度从高到低顺序依次为VT1000菌剂组、EM菌剂组和强兴菌剂组，与其对应的最佳原料配比均为3∶2。

图2 不同菌剂对物料全氮下降幅度的影响Fig. 2 Descent range of total nitrogen of materials tested in different microbial agents

2.1.3 对速效磷的影响

由图3可知，加入菌剂的3组物料中速效磷含量上升幅度明显高于空白对照组，说明菌剂中微生物的活动对物料速效磷含量的提高具有促进作用。其中，VT1000和强兴菌剂处理后物料速效磷的上升幅度随物料中果皮蔬菜混合垃圾比重的增加而增加；添加EM菌剂物料中速效磷的上升幅度以3∶3配比为分界，混合物料中果皮蔬菜混合垃圾含量较高的为物料配比为 3∶4、3∶5、3∶6 的处理，其速效磷上升幅度分别为 70.42%、71.02%、74.90%；而物料中秸秆比例较高的处理（3∶0、3∶1、3∶2）速效磷上升幅度分别为2.66%、44.19%、51.49%，前者速效磷的上升幅度明显高于后者。

图3 不同菌剂对物料速效磷增长幅度的影响Fig. 3 Increment range of available phosphorus of materials tested in different microbial agents

2.1.4 对速效钾的影响

由图4可知，菌剂处理的3组物料速效钾上升幅度均比空白组有明显提高，说明菌剂中微生物的活动对物料速效钾含量的提高具有明显的促进作用。其中，VT1000菌剂处理的物料，速效钾上升幅度最高的物料配比为3∶3，其次是3∶2，上升幅度分别为83.60%、80.46%；EM菌剂处理的物料，速效钾上升幅度最高的配比为 3∶2，上升幅度为75.34%；强兴菌剂处理后速效钾上升幅度最高的配比为3∶4，上升幅度为72.11%。分析可知，VT1000菌剂对物料速效钾含量提高的幅度明显高于其他菌剂，且受物料本底值影响较小，不同原料配比速效钾上升幅度差距不大，说明VT1000菌剂在提高速效钾方面适用的比例范围更广且更优。

图4 不同菌剂对物料速效钾增长幅度的影响Fig. 4 Increment range of available potassium of materials tested in different microbial agents

2.1.5 对C/N的影响

由图 5 可知，对照组不同配比（3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5、3∶6）物料的 C/N 依次为 38.53、22.93、19.40、18.04、17.08、15.65、14.93，其中，3∶4 配比处理下降幅度最高，为62.87%；EM菌剂处理物料的 C/N 依次为 21.49、15.11、14.81、14.44、12.70、12.49、11.88，除3∶0空白外，3∶2配比处理下降幅度最高，为73.26%；VT1000菌剂处理物料的C/N依次为23.52、20.49、16.78、14.68、13.91、13.74、13.12，除3∶0空白外，3∶2配比处理下降幅度最高，为 72.39%；强兴菌剂组处理物料的 C/N依次为20.43、16.13、15.59、14.59、14.36、14.19、13.67，除 3∶0空白外，3∶1配比处理下降幅度最高，为74.27%。

综上所述，3种菌剂处理物料，C/N下降幅度从高到低依次为EM、强兴和VT1000，其中EM、VT1000两种菌剂处理的物料在原料配比为 3∶2时C/N下降幅度最高，分别为73.26%和72.39%；强兴菌剂处理的物料C/N在原料配比为3∶1时下降幅度最高，为74.27%。

2.2 3种菌剂对物料降解性能的影响

图6 不同菌剂处理物料半纤维素降解率Fig. 6 Hemicellulose degradation rate in different microbial agents

图5 不同菌剂处理物料的C/N变化Fig. 5 Change of the C/N ratio of materials tested in different microbial agents(a) Blank control group; (b) EM group; (c) VT1000 group; (d) QX group

由图6可知，随着物料中果皮蔬菜混合垃圾所占比例的不断增加，4组物料半纤维素降解率均呈现出先上升后下降的趋势。其中，VT1000菌剂对物料半纤维素的降解率最高，当水稻秸秆与果皮蔬菜混合垃圾配比为3∶2时，半纤维素降解率达到最高，为60.09%；EM菌剂与强兴菌剂的半纤维素降解率相差不大，EM 菌剂于 3∶2时达到峰值，为52.62%；强兴菌剂于3∶3时达到峰值，为54.79%。原料配比3∶2最适宜微生物对秸秆进行降解，且降解效果最佳的为VT1000菌剂。

2.3 不同菌剂对物料微生物群落结构的影响

菌剂中微生物种群结构是影响物料理化性质和半纤维素降解率的关键，本研究采用高通量测序技术，对比分析了经EM菌剂、VT1000菌剂、强兴菌剂分别处理后，配比为3∶2的物料中细菌群落和真菌群落的相对丰度和优势菌群，从微生物学角度探讨3种菌剂对物料微生物群落结构的影响。

2.3.1 物料中细菌相对丰度

由图7可知，不同菌剂处理后物料细菌门级分类的优势菌群为 Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）和 Chlorobacteria（绿弯菌门），4组处理相对丰度均占75%以上。其中 Proteobacteria相对丰度最大，为24.41%～29.74%；但Proteobacteria相对丰度在4个处理之间差异不大，仅EM处理略高于空白和其他两组处理。

图7 不同菌剂处理物料细菌的优势菌群相对丰度Fig. 7 Relative abundance of dominant bacteria of materials at phylum level in different microbial agentsWU_1 was used as control sample; EM_1 was treated with EM; VT_1 was treated with VT1000; QX_1 was treated with strong bacilli; Sample size n=4. The same below

2.3.2 物料中真菌相对丰度

由图8可知，不同菌剂处理后物料真菌门级分类的优势菌群为 Ascomycota（子囊菌门）、Zygomycota（接合菌门）、basidiomycota（担子菌门）和Unclassified-k-Fungi（未经分类的真菌）；其中，Ascomycota的相对丰度最大，为 70.00%～98.06%，占据绝对优势菌群的地位。与对照组相比，加入菌剂的3组处理，Ascomycota的相对丰度均有不同程度的降低，降低幅度从高到低依次为EM、强兴、VT1000，与物料C/N降低幅度由高到低的顺序相同，说明Ascomycota与物料C/N的变化存在一定关联。

图8 不同菌剂处理物料真菌的优势菌群相对丰度Fig. 8 Relative abundance of dominant fungi of materials at phylum level in different microbial agents

3 讨论

微生物菌剂处理秸秆是根据秸秆的性质和结构选取适宜的微生物菌种，分解秸秆中的有机质和纤维结构，使之转化为CO2、水、矿物质及热量。由上述研究结果可知，不同菌剂处理对秸秆混合物料的理化性质、降解性能和微生物种群结构均产生了不同程度的影响。

3种菌剂处理物料的全碳含量与空白组相比，均有不同程度的降低，说明菌剂对物料中有机质的降解具有促进作用，其中，碳素是微生物代谢的能源，其含量能反映出微生物的代谢程度（余文娟等，2014）。本研究中所用的不同菌剂中的微生物其利用有机质进行代谢呼吸能力也不尽相同，微生物通过自身作用，代谢和消耗物料中的大分子有机物质，使其中一部分有机物质被降解为更容易被利用的小分子有机物，形成腐殖质，而另一部分则以CO2的形式散失（Michel et al.，1996）。

氮源对菌体的迅速增长起到至关重要的作用，是满足微生物自身生长繁殖代谢等活动所必需的营养元素。添加菌剂后，其中的微生物活动加速了物料中全氮的分解，物料中的有机氮被快速矿化，大大提高了氮素的降解速度，一部分为微生物自身代谢和繁殖提供氮源，一部分变成氨气迅速流失，从而导致物料中总氮含量下降（武志海等，2017）。VT1000菌剂中微生物对物料全氮的利用效果较好，最适宜原料配比为3∶2，可能是由于 VT1000菌剂中的优势菌种较其他两种菌剂对氮的需求量更高，利用氮源合成自身所需的能力更强所致。

磷可以有效提高植物抗击恶劣环境的能力（张福锁，1993）。不同菌剂作用下物料速效磷的上升幅度从高到低顺序依次为EM菌剂、VT1000菌剂和强兴菌剂，说明物料中果皮蔬菜混合垃圾的含量越高越有利于微生物提高物料中的速效磷含量。而不同菌剂处理物料对速效磷的提高幅度不同，可能与菌剂中所含的优势菌群或某种与速效磷相关的菌种的存在有关。

钾对维持植物的光合作用、呼吸作用、养分运输以及许多酶系统的功能有很大作用。随着物料中果皮蔬菜混合垃圾所占比重的不断增加，EM菌剂和强兴菌剂使速效钾提高幅度均呈现出先上升后下降的趋势。说明，EM菌剂和强兴菌剂提高物料中速效钾的能力受物料本底值影响较大，EM菌剂对秸秆含量比较高的物料速效钾提高效果更明显，而强兴菌剂则相反。因此，VT1000菌剂处理秸秆后提高物料中速效钾的能力较强。

经EM、VT1000、强兴菌剂和无菌剂处理后，4组物料降解后C/N均有明显下降。而处理前的物料C/N随果皮蔬菜混合垃圾在物料中所占比重的增大而逐渐降低，4组物料下降幅度基本一致。有研究表明（Pedraza-Zapata et al.，2017），当物料中C/N较高时，微生物会通过多次的循环氧化，利用和消化过多的碳，直至形成适宜生长的C/N环境。

微生物对秸秆进行降解是其生长过程中的一系列酶系反应的结果（史小丽，2001；姜洁，2010）。在不同菌剂处理秸秆过程中，果皮蔬菜混合垃圾的添加量过多和过少都不利于微生物对秸秆的降解。当秸秆中添加的果皮蔬菜混合垃圾过多时，物料结构过于致密，透气性差，制约了好氧菌的生长代谢活动，降低了微生物对半纤维素降解的速度（刘卫星，2004）；当秸秆中添加果皮蔬菜混合垃圾过少时，物料中C/N过高，碳素营养过剩，氮素养分相对缺乏，营养的不平衡也限制了微生物的生长。

有研究显示，Proteobacteria是细菌中最大的一个门，其中许多类群可以进行固氮作用，并且能够适应各种复杂的环境（Liu et al.，2014；罗培宇，2014），因此环境条件的变化对其分布和相对丰度影响不大。也有研究表明（张玉洁等，2017），生物炭在秸秆还田过程中有加速秸秆降解，提高土壤多样性的作用，在对其进行 PCR-DGGE分析时发现Proteobacteria在细菌门中所占的比例明显升高，说明Proteobacteria对秸秆的降解具有明显的促进作用。Actinobacteria有促进土壤中动植物残体腐烂的能力，可以有效促进秸秆腐解的过程（Lauber et al.，2008）。本研究中强兴菌剂处理的Actinobacteria相对丰度最大，而EM、VT1000处理与空白相比却降低了物料中Actinobacteria的相对丰度，这可能与 EM、VT1000两种菌剂本身所含的微生物菌群有关，这两种菌剂中其他的优势菌群的生长抑制了Proteobacteria的增加。Acidobacteria（酸杆菌门）是新近分出的一门细菌，广泛分布在土壤及沉积物中，为嗜酸菌，相关研究较少，但它们在生态系统中具有重要作用。有研究显示，物料中优势细菌类群相对丰度与物料理化性质有一定的相关性（李聪，2013）。本研究中EM、VT1000、强兴3种菌剂处理后的物料Acidobacteria相对丰度均明显高于对照组，且VT1000菌剂处理后的物料Acidobacteria相对丰度最大，为11.12%，EM其次，为9.00%。这与试验过程中物料全氮的下降规律和速效钾的上升规律相符，说明Acidobacteria的相对丰度与物料全氮呈显著负相关，而与物料速效钾含量呈显著正相关，这与王伏伟等（2015）研究得出的酸杆菌门相对丰度与土壤全氮含量呈显著负相关的结论相一致。Bacteroidetes（拟杆菌门）包括三大类细菌，即拟杆菌纲、鞘脂杆菌纲和黄杆菌纲。很多拟杆菌纲的种类生活在人或动物的肠道中，鞘脂杆菌纲的重要类群为噬胞菌属（Cytophaga），可以有效降解纤维素。杨腾腾等（2015）研究表明，Cytophaga hutchinsonii属于拟杆菌门，具有很强的结晶纤维素降解能力并推测其存在第3种细胞结合型纤维素降解模式。EM、VT1000和强兴3种菌剂处理的物料，优势菌群Bacteroidetes相对丰度较空白组均有显著提高，其中VT1000菌剂组与EM菌剂组的提高幅度相差不大，分别为18.34%和 17.20%；强兴菌剂组的提高幅度较小，为15.33%。由此也可说明VT1000菌剂处理物料半纤维素降解率较高的原因。Chlorobacteria（绿弯菌门）是一类通过光合作用产能的细菌，与拟杆菌门类群最近（Bryant et al.，2006），本试验中，4组处理 Chlorobacteria相对丰度差距不大，相对丰度从高到低的顺序依次为EM、VT1000、强兴菌剂处理的物料和不加菌剂的空白组，该顺序与4组处理中全碳含量由低到高的顺序和速效磷增长幅度由高到低的顺序相一致，然而其是否存在相关关系还有待进一步研究。

Unclassified-k-Fungi是一种未经分类的门级真菌，加入菌剂的3组试验Unclassified-k- Fungi相对丰度均明显高于对照组，不同处理相对丰度由高到低的顺序依次为 EM、强兴、VT1000，该顺序与物料C/N降低幅度由高到低的顺序完全一致，说明Unclassified-k-Fungi是影响物料C/N的主要因素。Zygomycota和basidiomycota均为典型的腐生菌，前者主要分布于土壤、牲畜粪便或其他腐败的有机物质上，后者是真菌中最高等的一门，分布广、数量大、种类多，能与植物共生形成菌根（mycorrhiza），有利于作物的栽培和造林；本研究中 EM菌剂处理的 Zygomycota和basidiomycota相对丰度明显高于其他菌剂处理组，这可能是 EM 菌剂较其他菌剂对物料全碳降解效果更好的主要原因。

4 结论

（1）3种菌剂均对秸秆的全碳、全氮、C/N具有降低作用，对速效磷和速效钾的含量具有提高作用；可加快半纤维素的降解。相对而言，EM菌剂对全碳、速效磷和 C/N的作用效果较好；VT1000菌剂对全氮、速效钾和半纤维素的作用效果较好。

（2）各菌剂于物料配比3∶2时处理效果最佳，采用EM菌剂处理后的物料全碳和C/N含量分别为8.19%和14.44，速效磷上升幅度为51.49%；采用 VT1000菌剂处理后物料全氮下降幅度为55.24%，速效钾上升幅度为 83.60%，半纤维素降解率为60.09%。

（3）采用高通量测序技术分析微生物群落结构对物料性能的影响，结果表明，EM菌剂处理的物料，优势菌群Unclassified-k-Fungi的相对丰度明显高于其他菌剂的处理，这直接影响物料的 C/N变化；而 VT1000菌剂处理的物料的优势菌群Acidobacteria相对丰度明显高于其他菌剂，其与物料中全氮和速效钾存在一定的相关性。