李克新，钱 程

（中央民族大学 生命与环境科学学院，北京 100081）

绿萝花为瑞香科（Thymelaeaceae）结香属滇结香（Edgeworthia gardneri）的干燥花蕾，是民族特色习用药材。据《藏医养生图说》[1]记载，绿萝花对糖尿病、高血压等具有良好的治疗效果。根据文献报道，绿萝花中含有黄酮类物质、香豆素、多糖、挥发油以及微量元素等多种化合物[2-4]。

本实验以绿萝花为研究对象，对其乙酸乙酯萃取层经反复柱色谱与循环制备液相色谱，得到5个化合物，并采用波谱学方法解析化合物的结构，采用1，1-二苯基-2-硝基苯肼自由基清除法（DPPH）对分离得到的化合物进行抗氧化活性评价，为更深入地研究和开发绿萝花的药用价值及资源的充分利用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器

材料：薄层色谱用青岛海洋化工厂分厂硅胶板，柱色谱用青岛海洋化工厂分厂柱硅胶和拌样硅胶，seph -dex LH-20，DPPH，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、丙酮等均为分析纯，仪器用甲醇为色谱纯，水为超纯水。

仪器：旋转蒸发仪，制备型高效液相色谱仪（LC-20AP），分析型高效液相色谱仪（LC-20A），循环制备色谱仪，多功能酶标仪（Enspire），超导核磁共振波谱仪（AVANCE 600MH）。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物的分离与鉴定

取600 g干燥的绿萝花药材，以75%的乙醇溶液采用溶剂提取法加热回流2 h，提取2次，合并滤液减压浓缩得到绿萝花总提取物100 g。用浸膏∶水=1∶40的比例溶解总浸膏，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩得到绿萝花乙酸乙酯粗提物10 g。经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯-甲醇（100∶0∶0-0∶50∶50）梯度洗脱、TLC薄层色谱合并浸膏，寻找适宜洗脱剂条件。再经硅胶柱色谱，凝胶柱色谱，减压硅胶柱色谱，循环制备色谱等色谱学方法分离，得到5种单体化合物。采用核磁共振氢谱法进行结构解析。

1.2.2 化合物抗氧化活性测定

采用DPPH自由基清除法测定化合物抗氧化活性。将化合物及阳性对照维生素E配制成1 mg/mL的母液，并梯度稀释配制成0.5 mg/mL至0.001 mg/mL的10个质量浓度溶液，DPPH溶液质量浓度为400 μg/mL。将样品及维生素E溶液依浓度梯度加入96孔板中，加样量为100 μL。再加入等体积DPPH溶液，并设置样品溶液和DPPH溶液空白对照。每组设置3个重复试验。将加液完成的96孔板置于多功能酶标仪中，在37 ℃下选择震荡10 s，并在酶标仪中静置30 min至反应完全，此后在517 nm波长下进行测量，读出吸光度值，计算清除率。

A0—DPPH溶液空白对照的吸光度测量值；A1—样品反应液的吸光度测量值；A2—样品及维生素E溶液的吸光度测量值。

2 实验结果

2.1 化合物结构信息

以绿萝花为研究对象，对乙酸乙酯粗提物经反复柱色谱与循环制备液相色谱分离纯化得到化合物。用TLC薄层色谱经3个不同体系进行显色，均为单斑，证明为单体化合物。结构信息如图1～5所示。

图1 tiliroside，R-H

图2 isoquercetin

图3 kaempferol-3-O-β-D-glucoside

图4 quercetin

图5 Caffeic acid

2.2 化合物结构鉴定

化合物1：在1H-NMR谱图中，显示存在苯环上典型的AA′BB′系统的氢信号，6.12（1H，d，J=1.7 Hz，H-6），6.35（1H，d，J=1.7 Hz，H-8）分别为苯环上6、8位的质子信号，可推断化合物的苷元部分为山奈酚，与文献数据对照基本一致[5]，故鉴定为银椴苷（tiliroside）。

化合物2：1H-NMR谱图与文献中槲皮素的1H-NMR谱数据非常相近，判断谱图中5.24（1H，d，J=7.2Hz，H-1’’）是β-D-葡萄糖端基质子。与文献数据对照基本一致[6]，故鉴定为异槲皮素（isoquercetin）。

化合物3：1H-NMR谱中，显示苯环上典型的AA′BB′系统，J=8.8 Hz，为B环上质子耦合，提示4′位有取代。δH6.33、6.15氢信号是AB系统，J=2.0 Hz，为A环上间位质子耦合，提示该化合物的苷元部分为山奈酚。δH5.19（1H，d，J＝6.0 Hz）为葡萄糖端基质子，由其偶合常数推断糖端基构型为β型。与文献数据对照基本一致[7]，故鉴定为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D -glucoside）。

化合物4：1H-NMR谱中，显示B环ABX自旋耦合系统中的H-2’，H-6’，H-5’信号；δH6.38，δH6.17的氢信号是AB系统，J=2.0 Hz，为A环上间位质子耦合，提示A环5，7位有取代。与文献中[8]槲皮素基本一致，故鉴定为槲皮素（quercetin）。

化合物5：1H-NMR谱中，根据δH7.02（1H，d，J=2.0 Hz），6.76（1H，d，J=8.8 Hz），6.95（1H，dd，J=8.8，2.0 Hz）为苯环上的ABX耦合系统的氢信号，分别为苯环上2，5，6位上的氢信号，根据δH7.52（1H，d，J=15.6 Hz），6.21（1H，d，J=15.6 Hz）判断苯环上接有一个反式双键，与文献[9]数据对照基本一致，故鉴定为咖啡酸（caffeic acid）。

3 结语

经多功能酶标仪测得，不同浓度的样品溶液和维生素E溶液在37 ℃下与等体积的DPPH溶液反应0.5 h后测得的吸光度计算抗氧化活性，得到以下结果。

与0.04 mg/mL的DPPH溶液反应，化合物1-5抗氧化活性IC50值分别为0.011 mg/mL，0.004 mg/mL，0.012 mg/mL，0.005 mg/mL，0.021 mg/mL，VE的抗氧化活性IC50值为0.006 mg/mL，则抗氧化活性2＞4＞VE＞1＞3＞5。