张 晨，王明宇，叶建伟，李新建，韩雪蕾，王克君，吕 刚，李改英，任广志，李 明，乔瑞敏

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450000)

确山黑猪具有适应性强，肉质细嫩、色暗红、富含大理石纹等优良特征。确山黑猪分布于确山周边，分布面积较广，数量较多，但因其生长速度慢、瘦肉率低，在1998年前后确山黑猪数量急剧下降[1]。线粒体DNA是高等动物体内的母系遗传物质，具有结构简单、保守型强、进化速率快等特点，是研究遗传进化的理想材料[2-3]。D-loop区是线粒体DNA上的一段非编码区，受进化压力小[4-5]，遗传变异程度高且进化速率快，是其他区段的5倍[5-6]，常被用来开展遗传进化研究。本研究通过扩增确山黑猪保种场内现存全部38头公猪个体的线粒体D-loop区段，分析该区段内的遗传多态性，评估确山黑猪的遗传多样性现状和品种内个体间的亲缘关系，旨在为后续有效保护和开发利用确山黑猪提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及基因组DNA提取

本研究中的确山黑猪来自河南省驻马店确山黑猪保种场，采集场内全部38头公猪个体的新鲜耳组织样品，置于1 mL 75%乙醇中保存，采用酚-氯仿法提取DNA[7]。利用Nanodrop 2000和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。

1.2 PCR扩增和测序

PCR扩增的上游引物为：5'-AGGAGACTAACTCCGCCAT-3'，下游引物为： 5'-CGCGGATACTTGCATGTGT-3'[8]，引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。采用25 μL的反应体系：包括40 ng DNA，12.5 μL 2×ES Taq MasterMix(康为世纪 CW2214M)，10 pmol正反向引物，8.5 μL水。扩增条件为：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；51.3 ℃，30 s；72 ℃，50 s，25个循环，72 ℃延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测合格后送往南京金斯瑞生物有限公司进行双向测序。

1.3 序列比对和进化分析

利用DNASTAR 7.1.0软件中的SeqMan程序对测序结果进行比较。将确山黑猪D-loop区序列与NCBI上公布的长白猪(NC_000845.1)的D-loop区段参考序列进行比对，比较二者之间的核苷酸序列差异，获得确山黑猪D-loop区的核苷酸变异情况。从NCBI上下载杜洛克猪(MF183225.1)、大白猪(KF752550.1)、莱芜黑猪 ( KJ720205.1)、二花脸猪(AF486861.1)的D-loop区序列。河南地方猪南阳黑猪、淮南黑猪、豫西黑猪的线粒体D-loop区序列来自本实验室的测序结果。利用DnaSP 5.0构建单倍型，用MEGA 7.0软件的最大似然法，对38头确山黑猪公猪个体的线粒体D-loop区及上述序列构建NJ系统进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测及测序

确山黑猪线粒体D-loop区的PCR扩增结果见图1，产物大小为1 175 bp。经过Sanger双向测序后，选取D-loop区内拷贝数变异(repeat_region)之前测序质量较好的630 bp片段，使用SeqMan对38头确山公猪的76条序列和参考序列进行比对，发现在确山黑猪中共检测到17个核苷酸变异(见表1)。

图1 确山黑猪线粒体D-loop区PCR产物电泳图1-9、11-17．确山黑猪；10.阴性对照；M.2000 bp DNA markerFig.1 Electrophoresis of PCR products of mitochondriaD-loop region of Queshan Black pigs1-9，11-17．Queshan Black pig; 10. negative control;M.2000 bp DNA marker

表1 确山黑猪D-loop区内的单核苷酸突变及单倍型分类Table 1 Single nucleotide polymorphisms and haplotypes of D-loop region of Queshan Black pigs

注：109-575表示17个核苷酸突变的位置；·表示与Hap 1相同碱基；-表示碱基缺失。

Note:109-575 represents the positions of 17 nucleotide mutations; · represents the same base as Hap 1; - represents base deletion.

2.2 单倍型及进化树分析

由表1知，38头确山黑猪分属于9种单倍型，依据单倍型内个体数的多少依次命名为Hap 1～ Hap 9。Hap1为优势单倍型，出现在21个个体中，Hap 2 ～ Hap 9依次存在于5、5、2、1、1、1、1、1个个体中。

由图2可见，确山黑猪相对聚为一簇，品种内的9种单倍型聚为7支，其中，Hap1和Hap4与其他个体关系稍远。增加分析河南省其它地方猪种，结果并没有增加D-loop区的单倍型数目。其中，南阳黑猪的单倍型同为Hap1，豫西黑猪、淮南黑猪的单倍型同为Hap4。确山黑猪与西方商业猪种总体的亲缘关系较远，与中国地方猪关系更近。确山黑猪与大白猪的关系稍近于杜洛克猪和长白猪；相比于莱芜黑猪，确山黑猪与与二花脸猪的亲缘关系更近。

图2 确山黑猪和西方商业猪种以及中国地方猪种D-loop区单倍型NJ进化树Fig.2 The neighbor-joining tree of haplotypes of D-Loop region in Queshan Black pigs and westerncommercial pigs and Chinese indigenous pigs

3 讨 论

河南省确山县大王山确山黑猪保种场内采用随机交配，场内放养、圈养相结合的饲养管理方式，为了更好地保护和开发利用确山黑猪，明确品种内不同个体的血缘关系是首要任务。本研究首次对确山黑猪开展遗传评估工作，通过测定现存全部38头公猪个体的线粒体D-loop区序列，分析其遗传多态性和个体间的亲缘关系。结果显示，与参考序列相比，确山黑猪存在17个核苷酸变异，个体间存在一定差异，17个突变分属于9种单倍型，说明确山黑猪的遗传多态性较为丰富，也在一定程度上提示确山黑猪的保种压力不大，可以进一步开发利用。

比较确山黑猪、与杜洛克猪、长白猪、大白猪及邻近地区猪种的D-loop区序列，为确定和利用确山黑猪的母系血缘提供参考。利用单倍型构建的进化树显示，确山黑猪母系血缘与西方品种距离较远，确山黑猪与大多数中国地方猪一样，与西方猪种相比单独聚为1类；品种内9种单倍型聚为7个分支，反映了确山黑猪品种内遗传多样性较为丰富，为当前的育种工作和生产服务提供了有效的分子水平的理论参考，为下一步的开发利用奠定了基础。鉴于D-loop区序列较短，有必要进一步对确山黑猪的全线粒体基因组和核基因组开展遗传评估。