柴亚男 ，郝娟 ，马雪莲 ，2，闫翠环 ，王香婷 ，2，许庆友 ，2

1.河北中医学院研究生学院，河北 石家庄 050091 2.河北省肝肾病证研究重点实验室，河北 石家庄 050091

梗阻性肾病是指因尿流障碍导致肾脏实质性损害的疾病，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin aldosterone system，RAAS)在其发病过程中发挥了重要作用，尤其是醛固酮，可以激活盐皮质激素受体(Mineralocorticoid receptor，MR)，诱导细胞增殖、表型转化、凋亡、炎性坏死以及自噬等，进而发展为肾间质纤维化。细胞增殖等已有较多的研究，而细胞自噬在其中的作用尚需深入观察。细胞自噬是真核细胞在溶酶体的介导下降解受损的细胞器和异常大分子蛋白，从而维持细胞内环境的稳定及形态功能完好的过程。Kim WY等[1]在单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction，UUO)所致梗阻性肾病的早期阶段检测到了自噬的发生，并证实其早于细胞凋亡和肾小管纤维化。本实验采用UUO建立梗阻性肾病的大鼠模型，诱导MR活化，给予益气活血解毒中药治疗，并采用血管紧张素II(Angiotensin II，AngII)受体拮抗剂缬沙坦作为阳性对照，通过检测自噬蛋白及相关通路的表达，探讨益气活血解毒中药对梗阻性肾病中细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选用清洁级雄性Wistar大鼠48只，体质量(180±20)g，购自河北医科大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1003，随机分为假手术组(Sham组)、模型组(UUO组)、缬沙坦组(Val组)和中药组(TCM组)，每组12只。

1.2 实验药物 缬沙坦购自诺华公司；益气活血解毒中药选用广东一方制药公司免煎颗粒(黄芪15 g，僵蚕、地龙、蝉蜕、乌蛇、丹参、鳖甲、赤芍、金银花、野菊花、蒲公英、当归各10 g，大黄6 g)，按比例混匀煎煮15 min，水煎液含生药4 kg/L，参照徐叔云《药理实验方法学》折合大鼠用量为14 g/(kg·d)给药。

1.3 试剂和仪器 糖皮质激素诱导蛋白激酶(Serum and glucocorticoid induced kinase，SGK-1)抗体选用Affbiotech产品，磷酸化细胞外信号调节激酶(Phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase，P-ERK)和 GAPDH抗体选用Bioworld Technology产品，mTOR、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated target of rapamycin，P-mTOR)和微管相关蛋白1轻链3(Microtubular-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗体选用Cell Signaling Technology产品，自噬相关基因5(Autophagy associated gene 5，Atg5)和 Beclin-1抗体选用Proteintech产品，免疫组化试剂盒选用北京中杉金桥生物技术有限公司产品。电泳仪及电泳槽(北京六一公司)，OLYMPUS VANOX PM-10AD型显微照相仪(OLYMPUS公司)，LEICARM 2245型石蜡切片机(LEICA上海分公司)，ODY-3059扫描仪(Li-cor公司)。

1.4 模型制备及给药方法 实验大鼠适应性喂养1周后，通过UUO建立梗阻性肾病的动物模型，用10%的水合氯醛以3 mL/kg的剂量通过腹腔注射麻醉动物，Sham组于左侧中腹部切开皮肤，仅将输尿管游离但不结扎不切断，逐层缝合皮肤；UUO组于左侧中腹部切开皮肤，游离左侧输尿管，分别在输尿管上1/3及下1/3处用丝线结扎后切断输尿管，逐层缝合皮肤；Val组和TCM组造模同UUO组。各组分别于造模前1天开始给药，造模当天不给药，缬沙坦组给予缬沙坦10 mg/(kg·d)灌胃；中药组给予中药煎剂14 g/(kg·d)灌胃；UUO组及Sham组均给予与治疗组等量的生理盐水灌胃。10天后处死动物，摘取梗阻侧的肾脏，一部分组织放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后切片行免疫组化染色；剩余组织-70℃保存，用于Western blot检测蛋白表达。

1.5 检测指标及方法 每组选取4只大鼠检测指标。采用SABC法检测LC3、Beclin-1、Atg5、P-mTOR的表达，一抗浓度均为1∶100。Western blot检测自噬蛋白、MR的激活及相关通路的表达。取冰冻肾脏组织100 mg加裂解液(含蛋白酶抑制剂)0.4 mL，提取蛋白并测定含量，配制相应浓度的浓缩胶和分离胶，加入上样蛋白适量，电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗 Atg5、Beclin-1、LC3II/I、SGK-1、P-ERK1/2、P-mTOR抗体(1∶1 000)，4℃过夜，次日TBS清洗3次，加入相应二抗(1∶20 000)孵育后TBS清洗3次，显影，与所得内参进行校正后比较。

1.6 统计学方法 数据资料采用SPSS21.0统计软件进行分析，结果满足正态性分布，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，数值变量以(±s)表示，两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织LC3、Beclin-1、Atg5和P-mTOR表达结果比较 见图1。Sham组的LC3、Beclin-1和Atg5呈弱表达，见于肾小管上皮细胞的细胞浆和细胞膜，而UUO组表达明显增强，主要见于肾小管上皮细胞的细胞膜；与UUO组比较，Val组和TCM组LC3、Beclin-1和Atg5表达均明显减弱。Sham组P-mTOR呈阳性表达，见于肾小管上皮细胞的细胞核，UUO组表达减弱；与UUO组比较，Val组和TCM组P-mTOR表达增强。

2.2 各组大鼠肾组织Atg5、Beclin-1和LC3II/I表达结果比较见表 1。与 Sham组比较，UUO组大鼠 Atg5、Beclin-1、LC3II/I表达明显增强(P＜0.01)；与UUO组比较，Val组和TCM组大鼠Atg5、Beclin-1、LC3II/I表达明显减弱(P＜0.05，P＜0.01)。

2.3 各组大鼠肾组织SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表达结果比较 见表2。与Sham组比较，UUO组SGK-1、P-ERK1/2表达明显增强(P＜0.01)；与UUO组比较，Val组和TCM组SGK-1、P-ERK1/2表达明显减弱(P＜0.05，P＜0.01)。与Sham组比较，UUO组P-mTOR/mTOR表达减弱(P＜0.01)，与UUO组比较，Val组和TCM组P-mTOR/mTOR表达增强(P＜0.01)。

图1 各组大鼠肾组织LC3、Beclin-1、Atg5和P-mTOR表达结果比较 (×400)

表1 各组大鼠肾组织Atg5、Beclin-1和LC3II/I表达结果比较(±s) μg/μL

表1 各组大鼠肾组织Atg5、Beclin-1和LC3II/I表达结果比较(±s) μg/μL

与Sham组比较，①P＜0.01；与UUO组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别S h a m组U U O组V a l组T C M组n 4 4 4 4 A t g 5 0.1 6 5±0.1 0 2 2.2 7 0±0.8 6 4①0.6 9 5±0.2 7 6③0.8 3 2±0.3 3 3③B e c l i n-1 0.1 9 5±0.0 8 6 0.3 6 5±0.0 4 0①0.2 6 0±0.0 9 0②0.2 7 0±0.0 9 2②L C 3 I I/I 1.3 7 5±0.2 6 2 4.7 8 0±1.1 6 7①3.4 3 8±0.2 5 2②3.6 0 8±0.4 5 8②

表2 各组大鼠肾组织SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表达结果比较(±s) μg/μL

表2 各组大鼠肾组织SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR/mTOR表达结果比较(±s) μg/μL

与Sham组比较，①P＜0.01；与UUO组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别S h a m组U U O组V a l组T C M组n 4 4 4 4 S G K-1 0.4 8 3±0.5 3 2 1.2 4 0±0.1 9 8①0.8 6 0±0.1 0 5②0.9 9 0±0.1 0 8②P-E R K 1/2 0.4 0 0±0.1 3 7 0.7 9 5±0.9 4 7①0.5 5 3±0.9 2 2③0.5 5 8±0.4 1 9③P-m T O R/m T O R 1.6 1 3±0.2 5 7 0.4 4 5±0.2 5 4①1.4 7 2±0.0 7 9③1.3 7 7±0.2 4 1③

3 讨论

UUO模型是研究肾间质纤维化的常用模型。有研究证实UUO可以促进醛固酮的分泌，醛固酮不仅可以调节钠离子及水分子的再吸收，还参与了炎症损伤和氧化应激等病理反应[2]，在UUO大鼠的肾脏中，富含线粒体和氧化酶的近端小管更容易受损[3]；我们之前通过检测UUO大鼠的血清及尿液中8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OhdG)含量，也证实了醛固酮很可能通过氧化应激加重肾脏损伤[4]。SGK-1是一种丝氨酸转移酶，参与了醛固酮诱导的氧化应激、炎性损伤和肾脏纤维化等病理过程，是反映醛固酮诱导脏器损伤的重要介质[5]。本实验采用Western blot检测SGK-1蛋白的表达，结果显示与Sham组比较，UUO组SGK-1的表达明显增强，证实醛固酮通过SGK-1通路诱导肾脏的损伤。

氧化应激不仅与醛固酮有密切的联系，也是影响自噬发展的重要因素。Chen Y等[6]提出在葡萄糖或血清等营养物质缺乏的情况下，活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)最初产物超氧阴离子自由基(O2-)参与了自噬的发生，当细胞处于饥饿状态时，H2O2分子会立即激活延伸进而诱导自噬的发生。LC3是自噬的标志性蛋白[7]，以LC3I和LC3II 2种形式存在于细胞中，当自噬发生时存在于细胞质中的LC3I经过泛素修饰过程与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，即转化为分子量较小的LC3II，并聚集形成自噬体膜，所以通常采用Western blot检测LC3II/I来评价自噬的活性[8]。Beclin-1是自噬基因Atg6/Vps30的同源基因[9]，通过与III型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)结合形成Beclin1-PI3K复合物，引导相关蛋白形成蛋白复合体，促进自噬体膜的形成[10]。本实验通过Western blot和免疫组化检测LC3和Beclin-1的表达证实了在UUO所致的梗阻性肾病中自噬的发生。

P-ERK1/2通路在营养缺乏或氧化损伤的条件下很容易被激活，有研究表明醛固酮与胞浆内受体结合，可快速诱导P-ERK1/2激酶的磷酸化[11]，通过P-ERK1/2磷酸化将信号从表面受体传导至细胞核，促进其与自噬相关基因的转录与表达。自噬过程主要受自噬相关基因(Atg)调控，其中Atg5在促进自噬的发展和减缓肾脏损伤的过程中起到了重要作用。在自噬体的延伸阶段，有Atg12-Atg5-Atg16复合物于其外膜结合[12]，该复合物的形成对自噬过程至关重要，因为其中任何成分的突变都会导致自噬缺陷[13]；Li HY等[14]用免疫荧光法分别检测敲除Atg5小鼠与未敲除Atg5小鼠中LC3II的阳性表达发现，与未敲除Atg5的小鼠相比，敲除Atg5小鼠中的细胞自噬明显受到抑制，且肾脏纤维化更严重。本实验中UUO组大鼠LC3、Beclin-1和Atg5的表达较Sham组明显增强，且与SGK-1、P-ERK1/2的表达增强相一致，说明MR活化后通过SGK-1通路和P-ERK1/2通路促进了梗阻性肾病中自噬的发生。

P-ERK1/2下游的P-mTOR通路也是调控自噬的1条重要通路，P-mTOR是1种存在于哺乳动物中的非典型的丝氨酸激酶，是自噬的负调控分子。梗阻性肾病早期生物体内的调节机制反应可以抑制P-mTOR的表达，激活细胞自噬，从而清除细胞内因输尿管梗阻产生的异常蛋白分子和过氧化物等物质[13]。本实验结果表明在UUO术后早期P-mTOR通路被抑制，自噬表达增强，当给予缬沙坦和益气活血解毒中药治疗后P-mTOR表达增强，自噬受到抑制。

RAAS激活后，AngII在胆固醇转化为孕烯酮环节发挥了重要作用，从而促进醛固酮的合成。缬沙坦是AngII受体拮抗剂，可以通过抑制AngII的作用阻断醛固酮的合成，所以选用缬沙坦作为阳性对照药物。

梗阻性肾病发病与中医学中的肾着、癃闭等疾病相似，其病因以脾肾亏虚为本，气血瘀滞，痰湿阻塞尿道为标，总属“虚、瘀、毒”范畴。气虚则卫外不固，邪气侵袭脏腑而发病；脾肾亏虚则气血津液运化失常，痰浊、水湿聚而成“瘀”；气血运行不畅，浊邪壅阻于内，日久成“毒”，治疗当“益气、活血、解毒”。方中黄芪益气扶正；丹参、赤芍活血散瘀；地龙、乌梢蛇、僵蚕、醋鳖甲通络散结；大黄、黄芩、金银花、蒲公英清热解毒。前期研究发现，益气活血解毒中药可下调炎性因子表达，减轻炎症损伤，减缓梗阻性肾病的进展[15]。本实验结果表明给予中药治疗后，UUO大鼠肾脏内醛固酮的活性降低，自噬的表达明显受到了抑制。

本实验观察益气活血解毒中药对梗阻性肾病中细胞自噬的影响，结果显示UUO组细胞自噬的表达与MR的活化程度均明显高于Sham组，而Val组和TCM组均受到抑制。可见益气活血解毒中药可以通过调控SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR通路抑制MR的活化，减缓梗阻性肾病中细胞自噬的发生，从而减轻肾脏损伤。