张丽娟, 汤兴娥, 姚美琪, 刘 怡, 赵翡翠

(新疆医科大学第四临床医学院， 乌鲁木齐 830000)

准噶尔乌头(AconitumsoongoricumStapf.)为毛莨科植物乌头的干燥块根[1]，主要分布于我国新疆伊犁地区和阿勒泰地区,生长在海拔 1 800～2 600 m的山地草地和阳坡[2]，其主要的化学成分为乌头碱、雪上一枝蒿乙素、3-脱氧乌头碱等生物碱[3-5]，具有散风寒、除湿、止痛等功效,临床上多用于风湿类疾病的治疗[6]。本课题组前期研究表明新疆准噶尔乌头的根中含有准噶尔乌头碱、乌头碱 、苯甲酰乌头原碱等化学成分[7-8]。本研究采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测对细胞增殖抑制的作用、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率评价细胞毒性、流式细胞术法检测细胞的凋亡情况，评价准噶尔乌头对H9c2细胞的细胞毒性作用,现报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞H9c2细胞(江苏凯基生物有限公司，批号JN-3317)。

1.2仪器Smart CeLL HF-90型CO2细胞培养箱(上海力康仪器有限公司)，HF1200LC型生物安全柜(上海力康仪器有限公司)，TGL-16GB型台式低速离心机(上海飞鸽仪器有限公司)，DNP-9272型恒温箱(上海精宏实验设备有限公司)，DHG 型恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，EcLipse TS100-F型荧光倒置显微镜(日本尼康公司)，xMarkTM型酶标仪(美国Bio-Rad公司)，DK-80型恒温水浴锅(上海精宏仪器厂)，YDS-50-125型液氮罐(成都金凤仪器厂)，BCD-249LCK型-20℃低温冰箱(合肥美菱公司)， DW-HL388型-80℃低温冰箱(合肥美菱公司)，Research pLus型手动单道移液器(德国Eppendorf公司)。

1.3试药胎牛血清(FBS,上海依科赛生物公司,批号FND500)，RPMI1640培养基(美国GIBCO公司,批号C11875500BT)，0.25%胰酶(法国SANOFI-AVENTIS公司，批号SC40020)(美国GIBCO公司,批号25200-056)，PBS磷酸盐缓冲液粉剂(北京中杉金桥生物公司,批号ZLI-9062)，LDH检测试剂盒(普利莱基因技术有限公司，批号 CK12)，青霉素-链霉素双抗(美国GIBCO公司,批号SC30010)，CCK8试剂(北京全式金生物公司,批号FC101-03)，DMSO(美国SIGMA公司,批号D2650)，乌头碱(成都曼斯特生物技术有限公司,批号A019)，准噶尔乌碱、12-表-欧乌碱为实验室自制。

1.4方法

1.4.1 溶液的制备方法 吸取FBS 5 mL，加入青霉素-链霉素溶液5 μL，用RPMI 1640培养基定容至50 mL，混匀即得10%FBS完全培养液，4℃保存，备用。分别量取RPMI1640培养基、胎牛血清、DMSO按(6∶3∶1)混匀，即得冻存液。按照说明书配制10% CCK-8溶液。称取准噶尔乌头碱、乌头碱、12-表欧乌头碱适量，配制成终浓度为200 mg/mL的标准溶液,后续不同浓度的溶液通过稀释获得。

1.4.2 H9c2细胞的培养方法 取H9c2细胞用含10%FBS和1%青-链霉素溶液的RPMI 1640培养基于37℃、5% CO2培养箱中过夜培养，镜下观察细胞生长密度，更换培养液后继续培养，待细胞生长至对数生长期后(细胞密度约占10 cm2培养皿面积的80%～90%)进行传代。超净台预先用紫外灯照射30 min，操作过程均保证无菌。用移液器吸弃培养皿中的培养液，用无菌PBS溶液冲洗细胞3次后弃去，加入500 μL胰蛋白酶消化，室温放置3 min于倒置显微镜下观察，轻晃培养皿如有细胞脱落，加入2 mL完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞完全脱落，放置离心管中1 000 r/min离心3 min,弃上清液，细胞悬液用完全培养基重悬，平均加于2个培养皿中，每个培养皿加入完全培养液8 mL，置于37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养后换液，根据细胞状态及密度定期进行换液或传代，计数接种于不同种类孔板，加药处理。

1.4.3 3种乌头碱对H9c2细胞增殖抑制率的测定方法 将H9c2细胞按“1.4.2”项下培养方法计数接种于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105个细胞/孔)，每孔加入完全培养基0.1 mL，37℃ 、5% CO2培养箱中过夜培养，弃上清液，考察不同药物浓度(乌头碱150、250、400、500、1 000 μg/mL，准噶尔乌头碱100、250、400、600、800、1 000 μg/mL，12-表-欧乌碱100.0、400.0、600.0、800、1 000 μg/mL)的细胞抑制率，每组平行6次，药物作用24 h后,每孔加入10% CCK-8溶液20 μL,37℃培养2 h,用酶标仪测定450 nm处各组细胞的吸光度A450，计算细胞抑制率。空白组细胞抑制率为0，其他各组细胞抑制率=(1-实验组A450/对照组A450)×100%。

1.4.4 3种乌头碱对H9c2细胞毒性作用的测定方法 将H9c2细胞按“1.4.2”项下方法培养，计数接种于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105个细胞/孔)，实验分为空白对照组(10%FBS 100 μL/孔)，实验组(乌头碱组100、400、500 μg/mL,准噶尔乌头碱组100、400、800 μg/mL, 12-表欧乌头碱组100、400、800 μg/mL)。每孔加入10%FBS 100 μL， 37℃、5% CO2培养箱中过夜培养，吸去培养液，用PBS洗涤1次，加入完全培养液，进行药物处理。各组细胞经给药后严格按照试剂盒说明书进行操作，计算细胞培养液LDH漏出率[细胞培养液LDH漏出率(%)=培养液LDH总活性/(培养液LDH总活性+细胞匀浆液LDH总活性)×100%，式中培养液LDH总活性=培养液LDH活性×培养液的体积；细胞匀浆液LDH总活性=细胞匀浆液LDH活性×细胞匀浆液蛋白含量×细胞匀浆液LDH体积]。

1.4.5 3种生物碱对H9c2细胞凋亡的测定方法 将H9c2细胞按 “1.4.2”项下方法培养，计数接种于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105个细胞/孔)，分为空白对照组(10%FBS 100 μL/孔)，实验组(乌头碱组100、400、500 μg/mL, 准噶尔乌头碱组100、600、800 μg/mL, 12-表欧乌头碱组100、400、1 000 μg/mL)，每孔加入10%FBS 100 μL，37℃、5% CO2培养箱中过夜培养，吸去培养液，用PBS洗涤1次，用胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞，PBS缓冲液轻悬细胞并计数。 取1×104个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，加入200 μL Annexin V-FITC结合液轻悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温下避光孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，加入200 mL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，然后加入10 μL PI染色液，混匀，避光孵育5 min。细胞悬液用200目筛网过滤，流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm， Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI的红色荧光通过PI通道(FL2)检测。使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置,计算细胞凋亡率。

2 结果

2.13种生物碱对H9c2细胞的抑制作用结果与空白对照组比较(浓度为0)，实验各组细胞体积变小,随着时间推移细胞皱缩成椭圆形、球形或其它不规则形状，细胞胞体的折光性下降,细胞胞浆内黑褐色沉积斑点增多。药物干预24 h后,细胞随药物浓度的增加逐渐出现死亡脱壁现象,显微镜视野中多见无核的细胞残片(见图1-3)。 与空白对照组比较，乌头碱组、准噶尔乌头碱组、12-表-欧乌碱组对H9c2细胞的抑制率随着药物浓度的增大而升高，差异有统计学意义(P<0.05)。乌头碱组、准噶尔乌头碱组、12-表-欧乌碱组IC50值分别为 562.06、726.80、766.11 μg/mL，见表1。

A: 正常对照组 B: 乌头碱低剂量组 C: 乌头碱中剂量组 D: 乌头碱高剂量组

A: 正常对照组 B: 乌头碱低剂量组 C: 12-表-欧乌碱中剂量组 D: 乌头碱高剂量组

A: 正常对照组 B: 乌头碱低剂量组 C: 准噶尔乌头碱中剂量组 D: 乌头碱高剂量组

表1 不同浓度乌头碱、准噶尔乌头碱、12-表-欧乌碱对H9c2细胞增殖抑制结果

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

2.23种生物碱的乳酸脱氢酶(LDH)漏出率实验结果与空白组比较，乌头碱组、准噶尔乌头碱组、12-表-欧乌碱组对H9c2细胞的细胞LDH漏出率均随着浓度的增大而升高，且呈一定的剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 LDH法评价不同浓度乌头碱、准噶尔乌头碱、12-表欧乌碱对H9c2细胞的毒性结果

注： 与空白对照组比较,*P<0.05。

2.33种生物碱的流式细胞术凋亡实验的结果与空白对照组比较(浓度为0)，在乌头碱浓度为400 μg/mL、12-表-欧乌碱浓度为400 μg/mL、准噶尔乌头碱浓度为600 μg/mL以上时，细胞的凋亡差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同浓度乌头碱、准噶尔乌头碱、12-表-欧乌碱流式细胞术凋亡实验的结果

注：与空白组比较,△P<0.05。

3 讨论

研究发现天然药物具有预防和治疗肿瘤的作用,天然药物已成为最重要的抗肿瘤药物来源[9-10]。与人体正常组织细胞相比，肿瘤细胞在形态、组织结构上都有不同程度的差异[11-15]。目前对准噶尔乌头的化学成分与药理作用的研究较少，研究方向主要集中在研究其粗提物的药理活性等方面，对其单体化合物的研究较少。本研究通过对大鼠心肌细胞(H9c2细胞)的细胞毒性研究发现，新疆准噶尔乌头中准噶尔乌头碱、乌头碱与12-表-欧乌碱这3种生物碱对H9c2细胞的增殖具有抑制和促凋亡作用,为抗肿瘤药物提供了心脏毒性安全性参考资料。