刘洁 曾烨 周珏宇 陈志超 张汉荣 赖姝彧 吴小丽 谭令梅 王雪飞

[摘要] 目的 探讨miR-519d对人宫颈癌细胞中CDKN1A/p21基因的靶向调控作用以及对细胞增殖、周期的影响。方法 通过荧光定量PCR技术检测miR-519d抑制物对其活性的调控作用。在宫颈癌HeLa和SiHa细胞中下调miR-519d表达，利用MTT法检测细胞增殖能力，通过流式细胞术检测细胞周期的分布情况。将miR-519d mimic转染HeLa和SiHa细胞，用荧光定量PCR、Western Blot分别检测p21 mRNA和蛋白水平的表达。利用双荧光素酶报告基因系统确认miR-519d与p21的靶向关系。 结果 miR-519d抑制物能有效下调宫颈癌HeLa和SiHa细胞内miR-519d的表达。MTT实验和细胞周期分析结果提示，下调细胞内miR-519d的表达能够显著降低细胞增殖活力，并使细胞周期阻滞于G1期。进一步通过双荧光素酶报告基因系统鉴定miR-519d能够结合p21 mRNA 3′UTR有效抑制其表达。qRT-PCR和Western blot检测结果表明，过表达miR-519d能在mRNA和蛋白水平上抑制p21的表达。 结论 p21是miR-519d的直接靶基因，miR-519d可能通过靶向p21调控宫颈癌细胞增殖。

[关键词] 微小RNA；宫颈癌；p21；细胞周期

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）21-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the role of miR-519d in the targeted regulation of CDKN1A/p21 gene in human cervical cancer cells and its effect on cell proliferation and cell cycle. Methods The effect of miR-519d inhibitor on its activity was detected by fluorescence quantitative PCR. The miR-519d expressions in cervical cancer cell HeLa and SiHa were down-regulated. The cell proliferation abilitywas detected by MTT assay， and cell cycle distribution was detected by flow cytometry. MiR-519d mimic was transfected into HeLa and SiHa cells， and the expression of p21 mRNA and protein was detected by fluorescence quantitative PCR and Western Blot， respectively. A dual luciferase reporter gene system was used to confirm the targeting relationship between miR-519d and p21. Results The miR-519d inhibitor can effectively down-regulate the expression of miR-519d in HeLa and SiHa cells of cervical cancer. The results of MTT assay and cell cycle analysis suggested that the down-regulation of miR-519d expression in cells could significantly reduce cell proliferation and arrest cell cycle at G1 phase. Further the dual luciferase reporter system identified that miR-519d was able to in combination with p21 mRNA 3'UTR and effectively inhibit the expression of p21. The results of qRT-PCR and Western blot showed that overexpression of miR-519d inhibited the expression of p21 at mRNA and protein levels. Conclusion p21 is a direct target gene of miR-519d， and miR-519d may regulate the proliferation of cervical cancer cells by targeting p21.

[Key words] MicroRNA； Cervical cancer； p21； Cell cycle

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种大小约21～25个碱基的单链小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物中，它可以通過与特定mRNA结合或调控特定mRNA的蛋白质翻译而影响基因表达。近年来，大量研究表明miRNA在肿瘤发生发展过程中扮演了重要的角色。miR-519d是我们前期的研究中发现的一个与细胞周期调控有关的RNA分子[1]，其定位于第19号染色体19q13.41区，是人体内最大的miRNA基因簇C19MC所在位置，最早发现它能抑制过氧化物酶体增殖物激活受体，引起脂肪酸代谢紊乱，与肥胖相关[2]。最近研究表明，miR-519d参与调控肝癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等[3-7]肿瘤中发生发展，与其诊断和预后有关。然而，它在宫颈癌进展中究竟扮演何种角色及其具体机制，仍有待阐明。本研究中，我们利用miR-519d inhibitor干扰宫颈癌SiHa和HeLa细胞内miR-519d的表达，利用MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期分布，综合表达谱芯片数据和生物信息学预测结果，明确靶基因CDKN1A/p21，以揭示miR-519d促进宫颈癌增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

胎牛血清、DMEM培养基（高糖）、Opti-MEM培养基、Lipofectamine 2000、Superscrpt Ⅱ逆转录试剂盒、双链cDNA合成试剂盒均购自美国Invitrogen公司，RNeasy mini试剂盒购自德国Qiagen公司，Trizol试剂、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒、psi-CHECK-2质粒DNA购自美国Promega公司。miR-519d模拟物mimic、抑制物inhibitor以及NC均由上海吉玛公司设计合成。荧光定量PCR引物由华大基因合成。四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）等购自Sigma公司。细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。p21、GAPDH蛋白抗体购自Abcam公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 仪器

CO2培养箱购自上海Thermo Fisher公司，ND-1000紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳系统购自美国NanoDrop公司，ABI 7500熒光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，GloMax生物发光检测仪购自美国Promega公司，FACSCalibur流式细胞购自美国BD公司，SDS-PAGE垂直电泳槽、酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3细胞培养与转染

HeLa、SiHa细胞均培养于含有10% FBS高糖DMEM培养液，于37℃、5% CO2条件下培养。转染过程如下：将小分子RNA（inhibitor/mimic或NC）稀释于200 μL Opti-MEM中，轻敲管壁混匀；每管加入5 μL转染试剂，轻敲管壁混匀，室温放置20 min，将RNA/Lipofectamin复合物加入2 mL的细胞稀释液，混匀后加入细胞培养板，根据需要于转染后不同时间点收集细胞。以上宫颈癌HeLa、SiHa细胞均购自中国科学院上海细胞库。

1.4 总RNA提取及荧光定量PCR

收集实验组（转染miR-519d inhibitor/mimic）和阴性对照组（Negative control，NC）细胞，根据Trizol试剂说明书进行总RNA的提取，随后按照逆转录试剂盒说明书操作进行cDNA的合成，分别用U6和GAPDH为内参进行qRT-PCR，检测miR-519d及p21的表达情况，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

1.5 MTT实验

先将细胞培养在96个孔中，每个孔中放入3000个细胞，随后miR-519d inhibitor/NC转染HeLa或SiHa细胞，于转染后24、48、72和96 h，在每孔中加入20 μL的MTT溶液（5 g/L），继续培养4 h后弃上清培养基，每孔加入150 μL DMSO，振荡混匀10 min后置于酶标仪上测定490 nm波长时每孔的吸光度A值以反映细胞生长活力。

1.6细胞周期检测

转染48 h后收集各组HeLa和SiHa细胞，用预冷的75%乙醇混匀4℃固定过夜，离心收集细胞，用200 μL的PBS重悬细胞并避光用PI孵育20 min，经BD FACSCalibur流式细胞仪检测各组细胞周期的变化。

1.7 Western blot实验

48 h后收集各组转染后HeLa和SiHa细胞，用RIPA细胞裂解液提取各组细胞中总蛋白，BCA法进行蛋白定量。每组上样30 μg总蛋白经行10%的SDS-PAGE凝胶，恒压电泳，恒流200 mA转膜2 h，室温封闭1 h，加入p21一抗，4℃孵育p21和GAPDH一抗过夜，加入二抗，室温孵育l h，洗涤后ECL化学发光显影，曝光扫描拍照。用Quantity One软件分析各组转染后细胞中p21蛋白相对表达情况。

1.8 双荧光素酶报告实验

通过上述Targetscan网站预测的miR-519d与候选靶基因p21的3′ UTR的结合部位，将野生型和突变型3′ UTR序列分别插入双光素酶报告基因质粒 psi-CHECK-2中，从而获得野生型（wt）和突变型（mt）的双荧光素酶报告质粒，并经测序鉴定。随后，将野生型或突变型质粒分别与miR-519d mimic或NC共转染宫颈癌HeLa和SiHa细胞。待转染48 h后收集且裂解细胞，使用Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒测定Renilla luciferase与firefly luciferase的活性，并计算各组中两者的比值。

1.9 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，组间差异采用单因素方差分析或t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-519d抑制物对宫颈癌细胞内miR-519d表达水平的影响

前期研究中发现miR-519d的表达在宫颈癌临床组织标本中高表达。因此，本项目拟采用miR-519d抑制物下调其活性以观察其对细胞增殖、细胞周期的影响。qRT-PCR结果显示，与NC转染组相比，宫颈癌HeLa和SiHa细胞中miR-519d抑制物能显著降低其表达，可作为后续活性调控的有效方法（P<0.05），见图1。

2.2下调miR-519d活性对于宫颈癌细胞增殖能力的影响

MTT法检测转染miR-519d inhibitor对于宫颈癌细胞HeLa和SiHa增殖能力的影响。结果发现，miR-519d inhibitor转染HeLa和SiHa细胞后能够降低细胞生长活力（图2）。与NC组相比，转染后24～96 h时段内，miR-519d inhibitor能显著降低HeLa及SiHa细胞的生长活力，差异具有统计学差异（P<0.05）。

2.3 下调miR-519d活性对于宫颈癌细胞周期的影响

流式细胞术检测发现，miR-519d inhibitor转染宫颈癌HeLa和SiHa细胞后能阻滞细胞周期进程。如图3所示，与NC组相比，miR-519d inhibitor转染宫颈癌HeLa和SiHa细胞后，G1期比例明显升高，而S期细胞比例显著下降（P<0.05），而G2/M期无明显差异，说明下调miR-519d的活性可能通过影响细胞周期G1/S监测点而发挥作用。

2.4 p21是miR-519d的直接靶基因

为了进一步探讨miR-519d影响宫颈癌细胞增殖、周期的具体机制，采用Targetscan等生物信息学软件预测其靶基因，发现p21与细胞周期调控相关，并根据结合位点设计双荧光素酶报告质粒的插入序列（图4a）。荧光素酶报告实验结果提示，与NC组相比，HeLa和SiHa细胞中，miR-519d mimic可显著抑制p21野生型3′ UTR的荧光素酶活性，而对种子序列突变型3′ UTR的荧光素酶活性没有明显的抑制作用（图4b）。此外，宫颈癌细胞HeLa及SiHa中上调miR-519d的表达对p21的mRNA及蛋白水平均起到负性調控作用（图4c、d）。上述结果证明了miR-519d能够靶向作用于p21，在转录及转录后水平上抑制靶基因的表达，从而促进宫颈癌的发生发展。

3讨论

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。高危人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）感染是宫颈癌发生的必要因素。研究表明，HR-HPV表达的癌蛋白E6和E7，能分别结合并降解宿主细胞p53和RB家族蛋白，并通过一系列分子改变，引起细胞周期、增殖、侵袭、转移等生物学行为改变，促进细胞的恶性转化，最终导致宫颈癌发生与进展。然而，单纯的HPV感染并不足以诱导宫颈癌的发生，提示必然有其他未知因素的协同作用[8]。

近年来，随着miRNA功能研究的不断深入，越来越多的证据表明，其在宫颈癌中扮演着重要的角色，在肿瘤诊断、复发、预后评价中具有广阔的应用前景，有望成为宫颈癌诊断、预后评价的新型标志物以及临床治疗的新靶点。前期的研究中，我们在HeLa细胞中发现miR-519d的表达水平具有周期性，很可能与细胞周期调控有关[1]。采用Targetscan软件分析其序列发现，miR-106a/106b/17/20a/20b/93/519d具有相同的seed序列（AAAGUGC），说明它们可能具有相似的功能。而miR-106b家族（miR-106a/106b/17-5p/20a/20b）能够靶向p21加速细胞通过G1/S关卡，发挥类似癌基因的功能[9]。此外，28种靶向p21的miRNAs中恰好包含上述miR-106b家族和miR-519d，且在绒癌JAR细胞中下调miR-519d可显著抑制细胞生长，并将细胞阻滞于G1期[10]。Lehmann等[3]发现，与男性乳房增生症患者相比，男性乳腺癌患者中miR-519d的表达明显升高。然而，Deng等[11]关于其在乳腺癌中的作用恰恰相反。同样地，对于肝癌中miR-519d的功能研究亦存在争议，如Hou等[4]研究发现miR-519d能靶向MKi67在肝癌中发挥抑癌基因的作用，而Fornari等[5]发现miR-519d在肝癌组织中高表达，能通过靶向p21、PTEN、AKT3、TIMP2而促进肝癌细胞的增殖、侵袭，抑制抗癌药物诱导的细胞凋亡的功能。但近期Fornari等[12]再次报道循环血液中miR-519d的表达随着肝硬化向早期肝癌、进展期肝癌的演进过程中逐步升高，这可能涉及miR-519d的胞外分泌机制。此外，miR-519d还能通过抑制TGF-β信号通路而促进肺癌A549细胞增殖[6]。Yue等[13]、Yang等[14]、Xie等[15]和Bai等[16]分别报道miR-519d在胃癌、结肠癌、乳腺癌及肺腺癌中具有抑癌基因的功能，但Hua等[17]报道miR-519d能促进黑色素瘤的进展，发挥癌基因的功能。上述研究充分说明，miR-519d的作用机制可能涉及细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡等信号通路，关于miR-519d在肿瘤中究竟扮演何种角色，可能涉及组织特异性的问题，相关领域值得进一步关注，其具体的分子机制仍需进一步探讨。

本研究证实miR-519d对宫颈癌细胞的生长增殖、周期具有明显的调控作用后，利用生物信息学软件预测到miR-519d的作用靶点，结合前期miR-519d的表达谱芯片数据，从中筛选到p21可能是其潜在靶基因，并对miR-519d靶向p21影响宫颈癌发生发展的作用机制展开了初步研究。p21是细胞周期的负性调控因子，是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinases inhibitors，CDKIs）家族中的重要成员。它既与肿瘤抑制作用密切相关，又能通过抑制周期蛋白依赖性激酶复合物的活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连。通过抑制cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2的活性，使Rb蛋白不能磷酸化，E2F不能释放，而使细胞周期停滞在G1期。本研究发现，在宫颈癌细胞中，上调miR-519d后，p21蛋白的表达水平显著降低；下调miR-519d的表达可抑制细胞增殖，并将细胞周期阻滞在G1期。

综上所述，miR-519d可通过靶向p21基因，调控其蛋白表达水平，进而可能影响宫颈癌细胞增殖及细胞周期等生物学行为，研究结果为进一步完善宫颈癌的发病机制提供重要的实验依据，也为宫颈癌的靶向治疗提供新的线索。此外，患者循环血液中miR-519d的表达水平也是今后值得关注的一个研究内容。

[参考文献]

[1] Zhou JY，Ma WL，Liang S，et al. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells[J]. BMB Rep，2009，42（9）：593-598.

[2] Martinelli R，Nardelli C，Pilone V，et al. miR-519d overexpression is associated with human obesity[J]. Obesity（Silver Spring），2010，18（11）：2170-2176.

[3] Lehmann U，Streichert T，Otto B，et al. Identification of differentially expressed microRNAs in human male breast cancer[J]. BMC Cancer，2010，10：109.

[4] Hou YY，Cao WW，Li L，et al. MicroRNA-519d targets MKi67 and suppresses cell growth in the hepatocellular carcinoma cell line QGY-7703[J]. Cancer Lett，2011，307（2）：182-190.

[5] Fornari F，Milazzo M，Chieco P，et al. In hepatocellular carcinoma miR-519d is up-regulated by p53 and DNA hypomethylation and targets CDKN1A/p21，PTEN，AKT3 and TIMP2[J]. J Pathol，2012，227（3）：275-285.

[6] Gennarino VA，D'Angelo G，Dharmalingam G，et al. Identification of microRNA-regulated gene networks by expression analysis of target genes[J]. Genome Res，2012， 22（6）：1163-1172.

[7] Pang Y，Mao H，Shen L，et al. MiR-519d represses ovarian cancer cell proliferation and enhances cisplatin-mediated cytotoxicity in vitro by targeting XIAP[J]. Onco Targets Ther， 2014，7：587-597.

[8] Martin CM，Astbury K，O'Leary JJ. Molecular profiling of cervical neoplasia[J]. Expert Rev Mol Diagn，2006，6（2）：217-229.

[9] Ivanovska I，Ball AS，Diaz RL，et al. MicroRNAs in the miR-106b family regulate p21/CDKN1A and promote cell cycle progression[J]. Mol Cell Biol，2008，28（7）： 2167-2174.

[10] Wu S，Huang S，Ding J，et al. Multiple microRNAs modulate p21Cip1/Waf1 expression by directly targeting its 3' untranslated region[J]. Oncogene，2010，29（15）：2302-2308.

[11] Deng X，Zhao Y，Wang B. miR-519d-mediated downregulation of STAT3 suppresses breast cancer progression[J].Oncol Rep，2015，34（4）：2188-2194.

[12] Fornari F，Ferracin M，Trerè D，et al. Circulating microRNAs，miR-939，miR-595， miR-519d and miR-494，Identify Cirrhotic Patients with HCC[J]. PLoS One，2015，10（10）：e0141448.

[13] Yue H，Tang B，Zhao Y，et al.MIR-519d suppresses the gastric cancer epithelial-mesenchymal transition via Twist1 and inhibits Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Am J Transl Res，2017，9（8）：3654-3664.

[14] Yang X，Hu Y，Liu Y，et al. C14orf28 downregulated by miR-519d contributes to oncogenicity and regulates apoptosis and EMT in colorectal cancer[J]. Mol Cell Biochem， 2017，434（1-2）：197-208.

[15] Xie Q，Wang S，Zhao Y，et al. MiR-519d impedes cisplatin-resistance in breast cancer stem cells by down-regulating the expression of MCL-1[J]. Oncotarget，2017， 8（13）：22003-22013.

[16] Bai Y，Lu C，Zhang G，et al. Overexpression of miR-519d in lung adenocarcinoma inhibits cell proliferation and invasion via the association of eIF4H[J]. Tumour Biol，2017，39（3）：1010428317694566.

[17] Hua KT，Hong JB，Sheen YS，et al. miR-519d promotes melanoma progression by downregulating EphA4[J].Cancer Res，2018，78（1）：216-229.

（收稿日期：2017-11-01）