林玲 王会河 罗元

[摘要] 目的 观察肿瘤转移相关基因Mta1（metastasis associated gene 1）及其蛋白在头颈部鳞状细胞癌中的表达，并探讨其临床意义。 方法 对86例头颈部鳞状细胞癌组织和20例头颈部正常组织用逆转录-PCR（RT-PCR）方法检测Mta1 mRNA表达，用免疫组化检测Mta1蛋白表达。 结果 Mta1 mRNA在86例头颈部鳞状细胞癌组织中平均表达水平（1.72±0.56）%与头颈部正常组织（0.93±0.68）%比较，差异具有显著性（P<0.01）；Mta1蛋白在头颈部鳞状细胞癌组织阳性率（65.12%，56/86）与对照组（15%，3/20）比较，差异具有显著性（P<0.01）。Mta1 mRNA及其蛋白在下咽癌、鼻咽癌、颈部皮肤鳞癌、淋巴结癌、扁桃体癌中平均表达水平及阳性率分别与头颈部正常组织比较，差异具有显著性（P<0.01）；Mta1 mRNA及蛋白在头颈部鳞状细胞癌中表达及阳性率与高分化、中分化及低分化等分化程度呈正相关（P<0.05）。 结论 Mta1 mRNA及其蛋白表达与头颈部鳞状细胞癌浸润转移关系密切，提示该基因可成为预测头颈部鳞状细胞癌转移和预后有价值的指标之一。

[关键词] 头颈部肿瘤；肿瘤浸润转移；Mta1基因；Mta1蛋白；RT-PCR；免疫组织化学

[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）21-0041-03

[Abstract] Objective To observe the expression of Metastasis Associated Gene （Mta1） and its protein in head and neck squamous cell carcinoma and its clinical significance. Methods Mta1 mRNA expression was detected by reverse transcription-PCR （RT-PCR） in 86 head and neck squamous cell carcinoma tissues and 20 normal head and neck tissues. The expression of Mta1 protein was detected by immunohistochemistry. Results The average expression level of Mta1 mRNA in 86 cases of head and neck squamous cell carcinoma was （1.72±0.56） compared with （0.93±0.68） in head and neck tissues. The difference was statistically significant（P<0.01）. The positive rate of Mta1 protein in squamous cell carcinoma of the head and neck （65.12%， 56/86） was significantly higher than that of the control group （15%， 3/20） （P<0.01）. The expression and positive rate of Mta1 mRNA and its protein in hypopharyngeal carcinoma， nasopharyngeal carcinoma， neck cutaneous squamous cell carcinoma， lymph node carcinoma， and tonsillar carcinoma were significantly different from those of normal tissues of head and neck， respectively（P<0.01）. The expression and positive rate of Mta1 mRNA and protein in head and neck squamous cell carcinoma were positively correlated with the degree of differentiation of well differentiated， moderately differentiated and poorly differentiated（P<0.05）. Conclusion The expression of Mta1 mRNA and its protein is closely related to the invasion and metastasis of head and neck squamous cell carcinoma， suggesting that this gene may be useful for predicting the metastasis and prognosis of head and neck squamous cell carcinoma.

[Key words] Head and neck neoplasms； Tumor invasion and metastasis； Mta1 gene； Mta1 protein； RT-PCR； Immunohistochemistry

頭颈部鳞状细胞癌发病率高，约为15/10万左右，占全身恶性肿瘤的16%～40%，在全身恶性肿瘤中其排第六位[1-2]。其发病率和病死率呈逐年增高趋势，严重影响人们的身体健康。虽然对头颈部鳞状细胞癌进行了大量的综合治疗和基础研究，但总的疗效仍不满意。为了解Mta1及其蛋白表达与头颈部鳞状细胞癌浸润转移的关系，本实验采用RT-PCR技术、免疫组化，检测了基因Mta1及其蛋白在头颈部鳞状细胞癌中的表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年4月～2017年7月年在广西医科大学附第一医院及第二医院耳鼻咽喉科取新鲜手术标本。实验组为86例头颈部恶性肿瘤组织，对照组为20例正常头颈部组织，86例头颈部恶性肿瘤标本经病理检查均证实为鳞状细胞癌，20例对照组标本病理證实为正常组织，比较基因Mta1在癌组织和正常组织的表达。86例头颈部恶性肿瘤组织包括40例鼻咽癌，27例下咽癌，9例颈部淋巴结转移癌，7例颈部皮肤鳞癌，3例扁桃体癌。其中11例为高分化鳞癌，25例为中分化鳞癌，50例为低分化鳞癌。男60例，女26例，年龄在30～78岁，平均年龄56.33岁。对照组20例：男12例，女8例，年龄19～65岁，平均年龄43.61岁。

1.2 方法

（1）总RNA的提取、鉴定：取冰冻组织50 mg加入Trizol试剂1 mL，在冰浴中匀浆，按Trizol试剂（Invitrogen产品）说明操作提取总RNA。总RNA A260 mm/A280 m=1.8，纯度符合要求，为完整性总RNA。（2）逆转录：采用逆转录试剂盒（RevertAid TM Fermentas产品）操作。反应体系：2.0 μg总RNA，1 μL随机引物，2 μL 10 mM dNTP，1 μL RNA酶抑制剂，4 μL 5X buffer，12 μL纯水，1 μL逆转录酶。25℃水浴10 min，42℃水浴60 min，70℃水浴10 min。得到的cDNA冰浴后备用。（3）PCR检测： 基因上下游引物：β2微球蛋白（内参照）为5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'，5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'（上海生工产品）；Mta1为5'-CACGCTTGGTTTCCGAGGAT-3'，5'-AGCTACGAGCAGCACAACGGGGT-3'，（上海生工产品）。采用PCR扩增试剂盒（SK2492 上海生工产品），反应体系为模板DNA 5 μL，Mta1基因引物（上、下游）10 μmol/L各0.8 μL，β2微球蛋白引物各1 μL，2 mM dNTP 5 μL，10×PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L MgCL2 5 μL，5 μ/μL Taq酶0.6 μL，2dH2O 25.8 μL，总体积为50 μL在MJ PTC-220 PCR仪循环。扩增反应条件：变性94℃ 60 s，退火58℃ 60 s，延伸72℃ 120 s，循环35次，最后一个周期延伸5 min。PCR半定量：取5 μL PCR产物置于2.3%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下观察结果。采用UVP自动凝胶图象分析系统测量Mta1（289 bp）及β2微球蛋白（118 bp）的吸光度值（A值），每例标本的相对A值等于Mta1A值和β2微球蛋白A值的比值。（4）免疫组化：采用福州迈新公司生产的即用型非生物素免疫组化EliVision plus检测试剂盒和美国SantaCruz公司生产的兔抗人Mta1蛋白单克隆抗体，严格按照试剂盒说明进行EliVision plus法染色。胞质出现棕黄色为Mta1蛋白阳性[3]，根据着色强度和阳性细胞数来综合判断，阳性细胞数≤10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分；0分：无色、1分：浅黄色、2分：棕黄色。着色强度和阳性细胞数两项之积≤3分为阴性，3～4分为阳性，>4分为强阳性。PBS代替一抗为阴性对照。两位病理科医师用双盲法分别观察每例切片，意见一致的结果为最终结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，采用Pearson分析方法进行相关性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Mta1 mRNA及蛋白在对照组和实验组中的表达

Mta1 mRNA及蛋白在头颈部鳞状细胞癌、头颈部正常组织中均具有不同程度的表达。Mta1相对A值及蛋白阳性率见表1。RT-PCR产物的电泳图谱见封三图5。Mta1蛋白阳性表达见封三图6。

2.2 Mta1 mRNA及蛋白在对照组、鼻咽癌、下咽癌、皮肤鳞癌、淋巴结癌及扁桃体癌的表达

Mta1 mRNA 及蛋白在鼻咽癌、下咽癌、皮肤鳞癌、淋巴结癌及扁桃体癌中的平均表达水平及阳性率分别明显高于正常头颈部组织，见表2。

2.3 Mta1 mRNA及蛋白表达与头颈部鳞癌分化程度的关系

Mta1 mRNA及蛋白在头颈部鳞状细胞癌中表达及阳性率与高分化、中分化及低分化等分化程度呈正相关（P<0.05）。见表3。

3 讨论

基因Mta1（metastasis associated gene 1）是与肿瘤转移有关的基因家族成员之一，最初从鼠乳腺癌细胞株中分离出来，被命名为肿瘤转移相关基因[4-6]。Mta1在人正常组织中表达水平低，而在人乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胃肠癌、食管癌、胰腺癌等癌组织中呈高表达水平。大量文献报道，基因Mta1与人恶性肿瘤组织浸润转移关系密切[7-13]。本实验结果显示，Mta1 mRNA在头颈部鳞状细胞癌组织中平均表达水平明显高于头颈部正常组织，Mta1蛋白在头颈部鳞状细胞癌组织中阳性表达率与头颈部正常组织比较，其差异均具有显著性（P<0.01）。Mta1 mRNA在下咽癌、鼻咽癌、颈部皮肤鳞癌、淋巴结癌、扁桃体癌中的平均表达水平分别明显高于正常头颈部组织，Mta1蛋白在下咽癌、鼻咽癌、颈部皮肤鳞癌、淋巴结癌、扁桃体癌中的阳性表达率分别与正常头颈部组织比较，其差异分别有显著性（P<0.01）。本实验结果和文献报道一致，结果显示Mta1 mRNA在正常组织中表达水平低或不表达，而在下咽癌、鼻咽癌、颈部皮肤鳞癌、淋巴结癌、扁桃体癌等头颈部鳞状细胞癌组织中表达水平明显增高，并且其蛋白表达阳性率也随之明显增高，Mta1 mRNA及其蛋白在头颈部鳞状细胞癌组织中表达具有一致性，说明基因Mta1与头颈部鳞状细胞癌细胞侵袭和转移密切相关，提示基因Mta1及基因产物在头颈部鳞状细胞癌细胞侵袭和转移过程中可能发挥重要作用。

研究证实人Mta1蛋白含有一锌指DNA结合域Cys-X2-Cys-X17Cys-X2-Cys和许多SPXX域，这些结构多见于基因结合蛋白和调节蛋白，参与了控制细胞分化和生长的信号传导途径的重要组成。本研究结果还显示，Mta1 mRNA及蛋白在头颈部鳞状细胞癌中表达及阳性率与高分化、中分化及低分化等分化程度成正相关（P<0.05），在高分化、中分化及低分化鳞状细胞癌中平均表达水平及阳性率均不同，并在高分化、中分化及低分化病理分级中随着其恶性程度的增高，Mta1 mRNA的表达水平及其蛋白阳性率都随之明显增高，在低分化鳞癌中Mta1 mRNA的表达水平及其蛋白阳性率都是最高值。说明Mta1 mRNA的表达水平及其蛋白阳性率与头颈部鳞状细胞癌的恶性程度具有密切相关系。提示在头颈部鳞状细胞癌细胞侵袭和转移过程中，Mta1基因及产物可能在信号传导路径中发挥重要作用[6]。

基因Mta1在头颈部鳞状细胞癌浸润转移过程中的确切作用机制，目前仍不明确。但本研究结果表明，基因Mta1在转录和翻译两个水平的表达与头颈部鳞状细胞癌浸润和转移相关[14，15]。Mta1基因虽然不是头颈部鳞状细胞癌特异性的指标，但头颈部鳞状细胞癌组织中Mta1蛋白的阳性表达可为判断头颈部鳞状细胞癌预后提供可能的资讯。

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（收稿日期：2018-03-26）