钟颖 牛婷 代洪波

摘要：为获得稳定表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母。人工合成PoIFN-α6基因片段，连接至pPICZαA质粒，构建PoIFN-α6毕赤酵母表达质粒pPICZαA-PoIFNα6；经SacI酶线性化后转化至毕赤酵母X33感受态细胞，筛选阳性克隆；优化毕赤酵母表达条件，并对表达产物进行了体外抗病毒活性测定。结果表明，成功构建了表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母，以1%甲醇诱导72 h后，菌体上清SDS-PAGE可见20 kDa左右目的条带，Western blot检测为阳性；表达的重组猪干扰素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系统中均具有良好的抗病毒活性。說明PoIFN-α6在细胞上清中表达成功，并且在不同宿主细胞中均有抗病毒活性。

关键词：干扰素，重组猪干扰素α6，毕赤酵母，抗病毒活性

中图分类号：S859.1 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2018）08-0005-03

近几年，猪瘟、猪伪狂犬病、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征等病毒性传染病在各大小型养殖场流行，给养猪业带来了巨大的经济损失[1，2]。而针对病毒性疫病尚无特效药物进行治疗。研究表明干扰素（IFN）是一类由单核细胞和淋巴细胞产生具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节功能的糖蛋白[3-5]。干扰素I型（尤其是IFN-α、IFN-β）因其生物活性，成为了目前研究最广的细胞因子之一[6，7]，到目前为止，尚未有重组猪干扰素α（Porcine interferon-α，PoIFN-α）类生物制剂上市。PoIFN-α包含17个家族蛋白，不同蛋白间氨基酸高度同源，均有良好的抗病毒活性[8]。PoIFN-α对猪繁殖与呼吸综合征病毒、水疱性口炎病毒、流行性腹泻病毒等引起的疫病有良好的预防与治疗效果[9-13]。此外，PoIFN-α还有免疫调节作用，Razzuoli等[14，15]发现，口服低剂量的PoIFN-α可以有效预防仔猪断奶期应激，增强仔猪的免疫抵抗力。

分泌型毕赤酵母表达载体pPICZαA，内含高效的启动子醇氧化酶（AOX1）、多克隆位点、分泌信号肽α、线性化酶切位点、抗性筛选标记和组氨酸标签等，是高效分泌表达、检测、纯化外源蛋白的常用载体[16]。与原核表达外源蛋白相比，酵母表达系统操作简单、表达蛋白具有天然构象（糖基化、蛋白加工等），具有更高的生物活性、易于高密度发酵培养、蛋白表达量高、成本低、易纯化等优点，在生产实践中应用越来越广泛。

本试验将PoIFN-α6基因连接到pPICZαA载体，构建pPICZαA-PoIFNα6表达质粒并转化毕赤酵母，获得高效表达PoIFNα6的毕赤酵母；对毕赤酵母表达的PoIFNα6进行体外抗病毒活性研究。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒、载体与菌株

牛肾细胞（MDBK）、猴肾细胞（Marc-145）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、猪肾细胞（PK-15）、水疱性口炎病毒（VSV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环二型病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、表达载体pPICZaA均由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室保存；E.coli DH5α感受态细胞、克隆载体pMD19-T购自TaKaRa。

1.2 主要试剂

DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量试剂盒购自AXYGEN；DNA Marker、T4连接酶、小鼠抗His单克隆抗体、HRP标记的兔抗小鼠IgG、DNA Marker、Protein Marker、蛋白胨、酵母氮源培养基、葡萄糖、YNB、W-TMB显色试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Xho I、XbaI和SacI限制性内切酶购自NEB（北京）；ZecionTM购自Thermo Fisher scientific。

1.3 PoIFN-α6表达载体的构建

参照GeneBank中的IFNα6（GenBank：GQ415060），5和3端分别加Xho I和Xba I酶切位点，酵母密码子偏嗜性由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成后将其克隆至pPICZaA载体中，将获得载体命名为pPICZαA-PoIFNα6。

1.4 PoIFNα6的表达与鉴定

将重组载体pPICZαA-PoIFNα6经SacI限制性内切酶线性化后转化至X33感受态细胞中，经含ZecionTM（200 μg/mL）抗性YPD平板筛选阳性菌落并挑取单菌落进行诱导表达，诱导72 h后收集细胞上清进行12% SDS-PAGE检测，以诱导转化空质粒的X33细胞上清为阴性对照。

SDS-PAGE结束后，利用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，PBST洗膜4次，每次5 min；将PVDF膜与小鼠抗HIS单克隆抗体（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，PBST洗膜4次，每次5 min；加入HRP标记兔抗小鼠IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min；进行W-TMB显色。

1.5 PoIFNα6活性测定

参照细胞病变抑制法[17]并根据不同细胞系/对应病毒（PRRSV/Marc-145、PEDV/Vero、PRV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15、TGEV/PK-15、VSV/MDBK）进行体外活性检测。细胞上清按10倍稀释，连续稀释7个梯度，每个梯度可设4个重复。中和的病毒含量为300～500 TCID50，同时设置阳性对照组和阴性对照组。当阳性对照组出现90%以上细胞病变时结晶紫染色，用酶标仪读取570 nm波长数值，根据Reed-Muench法计算细胞上清的抗病毒活性效价。

2 结果与分析

2.1 重组载体pPICZαA-PoIFN-α6的鉴定

将优化后的PoIFN-α与pPICZαA经双酶切后连接转化至E.coliDH5α感受态细胞中，ZecionTM（25 μg/mL）筛选平板筛选阳性转化子并进行PoIFN-α6菌落PCR鉴定（目标条带为1 035 bp）。经1%凝胶电泳分析，与预期一样。测序结果与GenBank中登录基因序列一致，表明重组质粒构建成功（图1）。

2.2 PoIFNα6的表达与鉴定

将载体转化毕赤酵母X33后，使用ZecionTM筛选平板挑取单个菌落，经1%甲醇诱导72 h后，离心取菌体上清经SDS-PAGE分析，在20～25 kDa处有特异目的蛋白条带（图2），大小与预期相符；而且Western blot检测表明该蛋白能通过his标签检测（图3），表明PoIFNα蛋白在细胞上清成功表达。

2.3 PoIFNα6活性研究

分别在PRRSV/Marc-145、PEDV/Vero、PRV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK15、TGEV/PK-15、VSV/MDBK系统上进行抗病毒活性检测，结果如表1所。由表1可知，干扰素在多种来源的动物细胞中均表现出良好的抗病毒活性，在不同来源细胞中的抗病毒活性有差异，但其比活力均大于106 U/mg。

3 讨论

当今猪病形式复杂，病毒性疾病占主导地位[18]，特别是近几年暴发的猪流行性腹泻、猪伪狂犬病给养殖行业带来了直接的经济损失。干扰素生物制剂由于其自身优势成为了研究热点。1986年，Lefevre[19，20]等首次利用大肠杆菌表达PoIFN-α。近年来，我国学者也相继开展了PoIFN-α的研究，实现了PoIFN-α原核表达。由于大肠杆菌表达的PoIFN-α多以包涵体形式存在，表达产物需要经过变性、复性等工艺处理后才有生物活性，但处理后的PoIFN-α活性損失较大、工艺复杂导致实际生产应用中难以实现[21-23]。与原核表达外源蛋白相比，酵母表达外源蛋白具有天然构象不需要经过变形、复性等处理就具有较好的生物活性；在生产实践中酵母具有高密度发酵培养、外源蛋白表达量高、成本低等优点，有良好的应用前景。

本试验成功获得稳定表达PoIFN-α6的毕赤酵母，并使用多种体外系统进行了活性测定。其中VSV/MDBK系统是猪干扰素抗病毒活性检测系统中使用最广泛的活性测定方法，在该系统中本研究所表达的重组猪干扰素活性（2.79×107 U/mg）比国内报道如：姚清侠[24]（8.0×106 U/mg）、葛丽[25]（4.0×104 U/mg）等略高。此外在多个系统中进行细胞病变抑制试验后发现，猪重组干扰素α6在猴源细胞Marc-145、Vero和猪源细胞PK-15以及牛源细胞MDBK中均表现出良好的抗病毒活性，且对不同种类病毒也具有较高的抗病毒活性。本试验结果表明猪重组干扰素α6具有广谱抗病毒活性，这种广谱性表现为对多种宿主的多种病毒的广谱抗病毒活性，没有种属特异性。

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