汪冠豪， 郭 亮， 郑璐璐， 许东坡， 刘 箐

(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093)

酒精滥用使人体组织液经常处于高浓度酒精环境中，神经系统会对此产生生理性依赖，个体逐步产生高酒精耐受性，从而进一步加大酒精摄入量，酒精戒断时产生焦躁心理，并表现出躁动、癫痫、震颤等症状，出现酒精戒断症状是酒精成瘾的临床标志[1]。目前国内外酒精成瘾群体日趋庞大，研究显示酒精成瘾与遗传相关[2]，酒精滥用对人体造成极大伤害，且影响社会和家庭的稳定，严重阻碍经济发展[3]。通过酒精饲养小鼠建立小鼠酒精成瘾模型对认识和治疗酒精成瘾至关重要[4]。酒精成瘾动物模型的建立应与人类摄入酒精方式接近，并且在戒断后出现与人体相似的戒断症状[5]。有资料显示[6]，使用自由饮酒的方法建造大鼠酒精成瘾模型，没有得到理想的酒精成瘾模型并且出现了骨质疏松、股骨头坏死等症状。Hwa等[1]使用双瓶选择的方式进行慢性酒精喂养，小鼠戒断后出现戒断症状，成功建立小鼠酒精模型，但此方法小鼠摄入酒精量较低，建模周期长，难以在短时间内得到理想的酒精成瘾模型。有研究显示酒精熏蒸的吸入模型可以使小鼠摄入足量的酒精[7]，此方法不符合人类酒精摄入模式。通过胃管灌胃的方式符合人体摄入酒精模式[8]，并且易于操作和定量。酒精成瘾患者在酒精戒断后出现焦虑、抽搐等戒断症状，有报道指出酒精成瘾与抑郁症存在关联性[9-10]，相关临床前研究也发现酒精成瘾与抑郁症存在关联[11]，临床研究也已证实抑郁症与酒精滥用有关[12]，且抑郁与酒精成瘾共病率高达70%。目前通过行为学结果判断精神性疾病被国内外广泛认可[13]，小鼠模型进行24 h酒精戒断后，采用旷场实验和强迫游泳实验观察小鼠的焦虑与抑郁程度，从而判断小鼠的精神状态与酒精成瘾的严重程度[14-16]。本研究采用两种喂养方法建立小鼠模型，并且制作小鼠内脏石蜡切片观察建模方法对小鼠模型内脏损伤程度[17]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Balb/c雄性小鼠，购自上海杰思捷实验动物有限公司。

1.1.2 试剂 白酒GB/T26760(贵州荣和黔水坊酒业有限公司)；苏木素染液、分化液、伊红染液 (北京索莱宝科技有限公司)；10%福尔马林、中性树胶 (BBI生命科学有限公司)；无水乙醇 (上海灵峰化学试剂有限公司)。

1.1.3 仪器与设备 正置荧光显微镜(DM2500，徕卡显微系统上海贸易有限公司)；旷场箱、强迫游泳箱、动物行为视频分析系统 (软隆科技有限公司)；石蜡包埋器(B64100011，赛默飞世尔科技有限公司)；石蜡切片器(Q/TFGV05-2005，赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及喂养方法 15只小鼠随机分为3组，即灌胃及酒水喂养组(A)、灌胃水喂养组(B)、对照组(C)，每组5只小鼠。每组小鼠饲养在一笼，固体饲料正常给予。水和酒按照一定比例添加将酒水中酒精浓度调至11%[18]，灌胃及酒水喂养组每天给予200 μL酒水溶液灌胃，并将酒水溶液作为唯一饮水来源。灌胃水喂养组每天给予200 μL酒水灌胃，自由获取自来水作为饮水来源。对照组不作处理，饲料饮水正常给予。记录每天小鼠的进食量及饮水量，8周后进行24 h酒精戒断并进行行为学实验。

1.2.2 小鼠自发活动试验(Open-field test，OFT) OFT是评估大鼠焦虑程度和探索活动的行为测试[19]，所有小鼠在开放场中单独测试，旷场装置由黑色方形基座(45 cm×45 cm)和黑色墙壁(45 cm)组成。将单只小鼠轻轻地放置在房间的角落，适应1 min后，使用视频计算机跟踪系统记录小鼠自发活动5 min运动路程与停留时间。总运动距离用作运动活动的指标，而在中心(内表面积的25%)运动的距离和停留时间比例认为是焦虑状态的指标。

1.2.3 小鼠强迫游泳实验(forced swim test，FST) 小鼠进行24 h酒精戒断后，将3组小鼠分别放入高30 cm、直径20 cm、水深15 cm的玻璃缸中，水温22 ℃左右，小鼠首先会出现游泳挣扎的状态，一段时间后会出现行为绝望的不动状态，反映出动物的焦虑抑郁状态[20]，观察6 min，记录最后4 min的绝对不动时间。

1.2.4 小鼠内脏切片 在小鼠建模过程中，持续大量摄入乙醇，乙醇在肝脏中先代谢为乙醛而后代谢为乙酸，经肾脏排出；小鼠喂养期间表现出进食减少、酒精摄入逐步增多。制作肝脏、肾脏、结肠切片观察建模过程中乙醇摄入对小鼠内脏造成的损伤，尽量避免造模方法造成小鼠死亡。小鼠酒精喂养8周后，每组小鼠随机各取3只，断颈处死后迅速取肝脏、肾脏称重，取结肠。用10%福尔马林固定24 h后，脱水，石蜡包埋然后切片，切片厚度取7 μm，再进行脱蜡、染色、脱水，二甲苯透明后置于显微镜下观察小鼠肝、肾、结肠组织形态变化。

1.2.5 统计学分析 数据经GraphPad Prism处理，组间显著性差异采用One-way ANOVA检验。

2 结果与分析

2.1 小鼠日均摄入液体、固体饲料量

在整个建模过程中，A、B两组小鼠在建模初期出现食欲不佳的状态，说明小鼠在开始对酒精有抵触。如图1所示，随着喂养时间的增长，第7周3组小鼠每日的液体摄入量趋近于一致，A、B两组小鼠的液体摄入量呈逐步升高状态，表明小鼠对酒精抵触有所下降并产生了耐受性。A组小鼠在建模过程中出现了嗜睡、反复梳理毛发等症状，进食量降低，酒精摄入量增多，体重减轻；B组小鼠进食量无明显变化，精神状态正常，毛发正常，体重略有降低。

2.2 小鼠自发活动实验

小鼠喂养8周后,A、B组小鼠酒精戒断1 d，进行旷场实验，结果如图2所示，A组小鼠运动总路程与对照组相比明显减少，在矿场中心运动路程与停留时间相比B组和对照组显著性降低。B组小鼠相比对照组总路程无明显变化，中心运动路程和停留时间相对对照组明显降低。表明A、B两组小鼠在酒精戒断后均出现了较高水平的焦虑状态，差异有统计学意义。

图1 小鼠每日液体摄入量(a)和固体饲料摄入量(b)Fig.1 Daily intake of mice(a) and solid feed intake(b)

图2 旷场运动总距离(a)、中心运动时间(b)、中心运动距离(c)Fig.2 Total distance of the mine movement(a), center movement time(b), center movement distance(c)

2.3 小鼠强迫游泳实验

小鼠喂养8周后，A、B组小鼠酒精戒断1 d进行强迫游泳实验，放入2 min后，记录后4 min各组小鼠的绝对不动时间。如图3所示，A、B两组小鼠与对照组相比绝对不动时间明显增长，表明A、B两组小鼠绝望水平、焦虑程度较高，差异有统计学意义。

2.4 小鼠体重和内脏质量

小鼠喂养8周后处死小鼠，迅速取肝、肾称重。如图4所示，A、B两组小鼠肝脏重量与对照组相比显著降低；A组小鼠肾脏重量与对照组相比显著降低，B组肾脏重量与对照组无明显差异，与A组肾脏重量有明显差异，差异有统计学意义。

图3 小鼠强迫游泳实验结果Fig.3 Experimental results of forced swimming in mice

图4 小鼠肝脏(a)，肾脏重量(b)Fig.4 The weight of mice liver(a) and kidney(b)

2.5 小鼠肝脏切片

如图5所示，在显微镜下观察小鼠肝脏组织切片，对照组肝细胞索状结构清楚，肝组织结构观察正常，肝窦正常，中央静脉完整，肝小叶的结构清晰可见；A组与对照组相比肝细胞胞质疏松,可见少量的脂肪细胞浸润,肝细胞体积表现为轻微增大，肝细胞索排列略有紊乱，组织内未见明显变性坏死及炎性细胞浸润。B组与对照组相比肝组织结构观察正常，肝小叶结构清晰可见，肝细胞体积无明显改变，未见明显水肿及出血，肝细胞索排列正常。与A组相比，B组建模方式对肝脏损伤较小。

图5 小鼠肝脏切片Fig.5 Mice liver slicesy

2.6 小鼠肾脏切片

如图6所示，在显微镜下观察小鼠肾脏石蜡切片，A、B组与对照组相比肾小管结构无肿胀变性，管腔正常, 管壁上皮细胞无明显变化，细胞核正常。B组与对照组相比肾小球大小正常，饱满，细胞核分布均匀，均无异常改变。A组与对照组相比，肾小球上皮细胞萎缩，空泡变性。与A组相比，B组建模方式对肾脏具有一定的保护作用。

2.7 小鼠结肠切片

如图7所示，在显微镜下观察小鼠结肠石蜡切片，A组与对照组相比肠固有层偶见间质增宽，肠绒毛出现破损，排列紊乱，肠绒毛顶端完整性降低。B组与对照组相比无明显变化，表明B组建模方法对结肠损伤较低。

图6 小鼠肾脏切片Fig.6 Mice kidney sections

图7 小鼠结肠切片Fig.7 Mice colon sections

3 讨 论

本研究旨在获得可靠的小鼠酒精成瘾模型，模型稳定且饲养方法对小鼠自身损伤较低。本研究引入小鼠行为学来反映小鼠的精神状态，符合人类酒精成瘾的精神状态。动物模型的建立是研究疾病生理机制的关键一步，模型的建立应与人类临床症状相似，建模过程中动物死亡率低且具有可重复性，造模过程应操作简便，成本低。本研究使用了两种方法建立小鼠酒精成瘾模型。B组小鼠急性定量灌胃法建立酒精成瘾模型，优点在于灌胃的方法更接近于于人类饮酒，可以控制酒精的摄入量，并且对肝脏、肾脏造成较小的伤害，降低了在建模过程中动物的死亡率。A组小鼠急性和慢性酒精喂养方法交叉使用，让小鼠最大量摄入乙醇，此方法虽然可以建立小鼠酒精模型，但单一将酒水溶液作为唯一摄入液体与人类饮酒规律不同，并且持续的慢性酒精摄入对肝脏、肾脏、结肠器官组织造成损伤，可能出现组织病变。在定义小鼠酒精成瘾方面国内外有不同的方法，有研究提出处理诱发症状[21](Handling-Induced Convulsion，HIC)，即对小鼠酒精戒断后所表现出来的一系列症状进行评估、打分，从而定义小鼠对酒精的依赖程度，但此方法主观因素影响较大。通过戒断症状来判定成瘾被临床医学所公认，并且酒精成瘾与抑郁联系密切，抑郁易引发酒精成瘾[22]。动物行为学实验[23-24]作为反映动物沟通行为、情绪表达、社交行为、学习行为、繁殖行为的金标，被广泛应用于动物学习、认知等神经科学实验中。本研究A、B两组饲养方法均成功建立小鼠酒精成瘾模型，为以后进行酒精成瘾的进一步研究提供了可靠的动物模型。