冯 敏， 吴红艳， 王志学， 郭玲玲， 李 赞

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

土壤是农业可持续发展的物质基础，是作物生长的重要营养源泉，土壤微生物是土壤的重要组成部分，其在土壤养分转化、循环、系统稳定性和抗干扰以及土壤可持续发展中占据主导地位。秸秆还田不仅可以改善土壤结构，提高土壤肥力，而且对土壤的生物学特性也具有很重要的影响[1]。微生物群落结构不仅决定了生态功能的特性和强弱，而且群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素，群落结构变化是标记环境变化的重要方面[2]。因此，通过对秸秆生物降解专用菌种施用后土壤菌群进行研究并分析其动态变化，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供依据。目前，微生物群落的分析方法很多，包括传统培养分离方法、CLPP、生物标记物方法、现代分子生物学方法等。研究表明，土壤中只有不到1%的微生物是可培养的，因此采用传统培养计数方法很难真实反映秸秆还田后土壤微生物结构的变化规律，而且繁琐耗时[3]，不能用于监测种群结构的动态变化。而现代分子生物学方法以微生物基因组DNA的标记序列为分类依据，通过分析不同DNA分子的种类及其数量来反映微生物的种群结构。方法包括群落水平总DNA分析、核酸杂交技术、克隆文库、基因指纹图谱技术等。目前每一类方法都有自身的优点和局限性，都处于发展和完善中，并相互补充相互推动。由于传统培养分离方法积累了种群分类的大量数据，为生物标记物方法和现代分子生物学技术提供了良好的背景材料(例如用作标准品或分子工具)，在功能特性的认识上有独特的优势。现代分子生物学提高了解析的灵敏度，在基因水平上扩大了物种多样性的视野，其中基因指纹技术(包括DGGE电泳系统化)可同时分析多个样品，通过电泳后条带的直观显示可分析种群结构的变化情况，从而分析秸秆生物降解专用菌种施用后对土壤群落动态变化的影响[4]。而这一方法是通过提取土壤中徽生物总DNA，经纯化处理后，利用合适的引物扩增，通过DGGE电泳分析扩增产物推断秸秆生物降解专用菌种施用后土壤中细菌数量变化规律。本研究通过对土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件的研究，并对结果进行比较，得出合适条件，对土壤中微生物数量变化规律进行分析，为后续的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 取样地点在辽宁省朝阳市北票市马友营乡农户蔬菜大棚内，实验样品为秸秆生物降解专用菌种施用后定期取得(施用后每15 d取样1次)。用无菌小钢铲取秸秆上0～10 cm土壤作为样品，过20目筛后备用。

1.1.2 试剂 溶菌酶、Hind Ⅲ、DL2000 maker及BamH I酶、DV805A胶回收试剂盒、TaqDNA聚合酶、聚丙烯酰胺、尿素、甲酰胺等均购自Takara公司。

1.1.3 仪器与设备 优普超纯水制造系统(UPH-120-1020L)，高速冷冻离心机(SiGMA 3K15)，恒温水浴锅，恒温培养箱(SPH-2102)，脱色摇床(TS-1，江苏自动化仪器厂)，恒压恒流电泳仪(DF-C，北京东方仪器厂)，紫外透射反射分析仪(ZF1-Ⅱ，上海嘉鹏有限公司)，PCR仪(Appolied Biosystems)，变性梯度凝胶电泳系统(TV400-DGGE)。

1.2 方法

1.2.1 土壤微生物基因组DNA提取的研究 具体方法参照文献[5-6]。①直接提取法样品处理：称取5 g土壤样品，与10.0 mL TE(pH 8.0)缓冲液(含玻璃珠)混合均匀，30 ℃摇床180 r/min震荡提取30 min,10 000 r/min离心15 min,洗涤1次，10 000 r/min离心15 min，收集沉淀即为沉淀1。②间接提取法样品处理：称取土壤样品5 g，与10.0 mL TE(pH 8.0)缓冲液(含玻璃珠)混合均匀，30 ℃摇床180 r/min震荡提取30 min,1 500 r/min离心20 min,收集上层浊液，洗涤沉淀1次，1 500 r/min离心15 min，合并上层浊液，10 000 r/min离心15 min，收集沉淀即为沉淀2。 ③直接提取法和间接提取法均按下述提取方法提取：分别将沉淀1、2置-20 ℃冰箱中冷冻过夜，次日融化后加入5 mL TE缓冲液(pH 8.0)混合均匀，加入200 μL(50 mg/mL)溶菌酶使用液(终浓度为1 mg/mL)，37 ℃水浴摇床120 r/min 2～3 h，加入10%(质量分数)SDS 1 mL(终浓度2%)，60 ℃水浴30 min，加入5 moL/L NaClO 42 mL(终浓度1 mol/L),混合均匀，加入等体积的氯仿∶ 异戊醇混合液，振荡10 min，5 000 r/min离心10 min，收集上清液，无水乙醇低温沉淀过夜，12 000 r/min离心20 min，收集沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心15 min，收集沉淀DNA，TE缓冲液(pH 8.0)溶解，置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 土壤中粗基因组DNA的纯化 DV805A胶回收试剂盒按说明书进行纯化回收。

1.2.3 土壤细菌16S rDNA V3区PCR扩增 具体方法参照文献[7]。引物为16S rDNA V3区扩增的通用引物并在序列中加入GC夹子，由赛百盛生物有限公司合成。扩增条件：采用降落式PCR,每个循环温度降低0.5 ℃。扩增体系见表1。

表1 土壤细菌16S rDNA V3区PCR扩增体系Table 1 V3 domain PCR amplification amplification system of soil bacteria 16S rDNA

1.2.4 DGGE电泳分离土壤细菌16S rDNA V3 PCR扩增片段 具体方法参照文献[8-9]。聚丙烯酰胺凝胶凝胶组成见表2，其中各组成中均加入APS 50 μL、TEMED 15 μL。

表2 聚丙烯酰胺凝胶凝胶组成Table 2 Gel Components of polyacrylamide gel

DGGE电泳条件及凝胶染色、显色：变性剂浓度分别为25%～35%、35%～55% 和35%～65%，电压为200 V，温度60 ℃，蠕动泵流速为5 mL/min，电泳时间为4～5 h，取下胶片后用银染方法进行染色，洗涤、显色。

2 结果与分析

2.1 土壤粗基因组DNA的提取及纯化

土壤粗基因组DNA的提取物凝胶电泳检测结果见图1。从图1可以看出，两种方法均从土样中提取到微生物基因组DNA，片段长度约为23 kb(如图A、B)，直接法得到小分子多，DNA碎片多，电泳时形成拖尾，但浓度较高；而间接法得到的DNA片段集中，小分子物质少，电泳拖尾情况相对较轻，但浓度较低。经过DV805A胶回收试剂盒纯化后得到足够纯度的土壤基因组DNA。

图1 土壤粗基因组DNA的提取物凝胶电泳检测结果Fig.1 Gel electrophoresis determination results of soil crude genotypic DNA extract

2.2 土壤细菌16S rDNA V3区PCR扩增

土壤细菌16S rDNA V3区PCR扩增后凝胶电泳检测结果见图2。由图2可以看出，所有扩增产物均在250 bp附近有一条明亮的DNA带，但是在100 bp附近也均有明亮程度不同的条带，即小分子物质，这些小分子物质条带1号和3号最为明亮，2号次之，最淡的为4号，说明4号扩增体系所得到的扩增产物比其他3个扩增体系得到的扩增产物较为纯净。

2.3 DGGE电泳分离

DGGE电泳分离土壤细菌16S rDNA V3PCR扩增产物结果见图3。从图3可以看出，变性剂浓度范围较大的35%～65%，电泳分离效果较差，拖尾现象严重，条带不清晰；而变性剂浓度较小且范围较小的25%～35%，样品在大分子处集中，DGGE电泳分离效果差，而变性剂浓度适中，范围在35%～55%时分离效果较好，条带清楚，因而可用于PCR扩增产物的DGGE分离。

图2 土壤细菌16S rDNA V3区PCR扩增后凝胶电泳检测结果Fig.2 Determination results by gel electrophoresis of soil bacteria 16S rDNA after V3 domain PCR amplification1：不含Mg2+和BSA；2：含Mg2+和BSA；3：含Mg2+但不含BSA；4：不含Mg2+含有BSA1: Not contained Mg2+and BSA; 2: Contained Mg2+ and BSA; 3: Contained Mg2+ but not contained BSA; 4: Not contained Mg2+ but contained BSA

图3 DGGE电泳分离土壤细菌16S rDNA V3 PCR扩增产物结果Fig.3 Results of V3 PCR amplified products of soil bacteria 16S rDNA isolated with DGGE

3 讨 论

在研究土壤中粗基因组DNA提取过程中，直接法和间接法提取所得DNA片段长度均在23 kb左右，与文献报道一致。另外，提取后除了进行琼脂糖凝胶电泳检测外，还进行了BamH I酶切反应及PCR扩增试验，结果表明，未经纯化的直接法提取得到的基因组DNA酶切反应不能进行，PCR扩增无法扩增出条带，这说明直接法提取的DNA中含有大量杂质，能强烈抑制PCR扩增和BamH I酶切反应，而纯化后可有效消除抑制因子的作用。由于直接法得到的基因组DNA中细菌种群更加丰富，所以对直接法得到的DNA纯化后再进行PCR扩增效果更好。

在进行PCR扩增体系和条件研究时，常规的体系中加入了BSA，以增强保护DNA聚合酶的活性，增强PCR反应过程中的特异性[10]；另外，在体系中试图加入Mg2+使其与DNTP相互作用，增加扩增产物的数量，结果作用不明显，未使用[11]；由于DNA分子中的G、C碱基对要比A、T碱基对结合得牢固，因此G、C含量高的区域具有较高的解链温度，使PCR扩增产物在DGGE电泳过程中不至于双链被完全打开，形成单链[12]。基于这一原理，在设计引物时加入了GC夹子，即将一段长度为30～50 bp富含G、C的DNA碱基片段附加到双链的一端以形成一个人工高温解链区，使DNA片段的原有部分处于低温解链区，从而实现更好地分离[13]。

DGGE电泳的聚丙烯酰胺凝胶组成和电泳条件决定电泳结果成功与否，其中变性剂浓度尤为重要，其次APS 和TEMED的加入量以及胶片取下后银染的时间等因素对于电泳结果也起到至关重要的作用[14-15]。

总之，通过对DGGE电泳相关条件的研究，明确了土壤中粗基因组DNA提取方法，确定了PCR扩增条件和DGGE电泳系统组成中变性剂浓度，为后续的相关研究提供理论依据。