黄雅楠， 王晓慧， 曹 琦， 傅学聪， 付文怡， 马 杰， 张 明

(华东师范大学 生态与环境科学学院 上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室，上海 200241)

随着我国农业和环保事业的发展，越来越多的禽畜粪便得到了无害化和资源化处理，如进行厌氧发酵生产沼气、好氧发酵生产乙醇和堆肥生产有机肥料等。堆肥则是最常见的一种形式[1-2]，是在人工条件下，使禽畜粪便保持在适宜的湿度、温度、pH、碳氮比和含氧量的环境中，借助固体堆中微生物的作用，促进有机物降解的过程[3]。堆肥一般分为两个阶段，第一阶段称为高温发酵阶段，微生物快速分解有机物，堆体温度因微生物活动产生的热量上升至55 ℃以上，可有效杀死堆肥中的病原微生物和寄生虫等[4]；第二阶段称为腐熟阶段，温度降至40 ℃左右，微生物进一步分解残余有机物，产生腐殖质。通常通过温度、pH值、含水率、C/N比、有机物质含量和微生物群落变化等判断堆肥是否腐熟。在堆肥过程中，微生物起到了主导作用。因此，分析堆肥过程中微生物群落结构变化及其多样性对进一步了解堆肥过程，优化堆肥处理工艺具有重要意义[5]。近年来，一些研究者通过变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术[6-8]分析了堆肥过程中微生物群落变化，但其中丰度较低的微生物用这些方法难以分析确定，而高通量测序技术则能够更加全面准确地分析微生物群落信息[9-10]。本研究运用高通量测序技术对猪粪堆肥过程中微生物群落结构变化开展研究，揭示其微生物多样性及其变化，以期为堆肥处理工艺的优化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 实验所用新鲜猪粪样品于2016年8月6日采自上海松江区泖港镇茹塘养猪场。该猪场圈存种猪1 200头，年产苗猪2.4万多头。堆肥中添加的玉米芯颗粒大小约5 mm。堆肥原材料理化性质见表1。

表1 堆肥原材料理化性质Table 1 Selected properties of compost materials

1.1.2 试剂 DNA抽提使用DNA快速提取试剂盒FastDNATMSPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，OH，USA)。

1.1.3 仪器与设备 堆肥pH值和温度测定：IQmeter IQ 150型pH计，美国SPECTRUM公司；堆肥有机碳、总氮测定：Vario EL cube元素分析仪，德国elementar公司；堆肥DNA抽提：The Mini-BeadBeater-1珠磨器，美国BioSpec公司。

1.2 方法

1.2.1 堆肥实验设计 堆肥实验于2016年8月7日至10月12日进行。将猪粪与玉米芯混合(湿重比为7∶2)，调节C/N为25，含水率为55%，将混合堆料至于泡沫盒堆肥，分别在堆肥第0、4、11和33天对堆体进行翻堆。

1.2.2 样品采集和DNA提取 猪粪堆肥时间共66 d，堆肥温度变化如图1所示。采集堆肥样品时间为第0天(新鲜猪粪，Z1样品)、18天(高温堆肥，Z2样品)和66天(腐熟堆肥，Z3样品)。采样时在堆体的上、中、下部分别采样后混匀。

图1 猪粪堆肥过程中的温度变化Fig.1 Changes of temperature during composting

1.2.3 高通量测序 将提取的DNA样品送上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA高通量测序。样品测序使用的引物是515F/907R，引物序列为515:5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，907R:5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′[11]，测序区域为V4～V5，测序平台为Illumina MiSeq，测序区为V4～V5区。对测序结果进行相应的高级信息学分析，获得样品微生物群落组成及相对丰度。

1.2.4 数据分析 先对测序原始数据进行过滤处理，得到优化序列，然后在去除嵌合体[12]序列后在97%的相似水平上进行OTU聚类，用Mothur软件做rarefaction分析，利用R语言工具构建稀释性曲线(rarefaction curve)[13]。利用软件Mothur(version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)，计算得到Chao、ACE、Shanon、Simpson和Coverage指数，并利用R语言分析样本在不同分类水平上的群落结构，得到微生物群落结构图[14-15]。

2 结果与分析

2.1 理化因子变化

微生物生长繁殖与pH值相关，堆肥过程中pH的变化与堆肥原材料的性质有关，因此pH 值可以作为一个堆肥腐熟的重要参考标志。有研究发现[16]，当 pH值在 7.5～8.5 时，堆肥效率最高。猪粪堆肥整个过程中的pH 值范围在7.8～9.0(图2)，达到了堆肥腐熟的要求，其变化规律整体呈现“降低-升高-降低”的趋势，变化波动幅度较小。

图2 猪粪堆肥过程中pH的变化Fig.2 Changes of pH during composting

适宜的水分能促进堆肥的腐熟，含水率在50%～60%之间能更好地促进堆肥[17]。本研究在堆肥过程中通过检测含水率并不定期加水使其保持在55%左右。

评价堆肥腐熟的另一个重要标志是碳氮比(C/N)，当C/N 值降到20以下，可认为堆肥已腐熟。由图3可知，猪粪堆肥在进行到第29天时C/N值已低于20，继续堆肥使其深度腐熟，直至堆肥结束C/N值下降至10左右，可以认为堆肥已完全腐熟。

2.2 测序结果

对Z1、Z2和Z3 DNA样品进行Illumina Miseq高通量测序，通过V4～V5区测序结果统计分析，分别得到37 009、42 470、36 713条有效序列；在97%的相似水平下对序列进行OTU聚类统计，分别获得328、280、160个OTU。3个堆肥样品的优质序列长度主要分布在381～400 bp，平均序列长度为395 bp。

图3 猪粪堆肥过程中C/N值的变化Fig.3 Changes of C/N during composting

稀释性曲线可以用来比较测序数据量不同样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本测序的数据量是否合理[18]。从稀释性曲线(图4)来看，当测序量超过25 000时，整个曲线已经趋于平缓，说明测序数据合理，能够较真实地反映样品中微生物种群的丰富度。从图4可知，从OTU数量上看，Z1>Z2>Z3，说明新鲜猪粪中微生物种类最丰富，高温堆肥次之，腐熟堆肥中微生物种类数明显减少。

图4 稀释曲线Fig.4 Rarefaction curves

2.3 Alpha多样性分析

Chao和Ace指数描述微生物群落丰度，数值越大，丰度越高；Shanon指数、Simpson指数描述微生物多样性，数值越大，说明群落多样性越高；Coverage指数反映测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。3个样品Alpha多样性分析结果见表2。

由表2可知，3个样品Coverage指数均达到0.99以上，再次说明了本次测序结果能够较真实地反映样品中微生物群落。由Chao指数和Ace指数可知，新鲜猪粪中微生物群落丰度均高于高温堆肥以及腐熟堆肥样品，这表明随着堆肥的进行，微生物群落丰度降低，至腐熟阶段丰度降低尤为明显。而Shanon指数、Simpson指数可知，堆肥过程中微生物多样性先略有上升而后明显下降，这与张晶等[19]研究结果相似。在Z2样品上Shannon指数和Simpson指数的变化与Chao和Ace指数的差异，主要是由于Shannon指数和Simpson指数计算时还包含了各种间个体分配的均匀性，高温堆肥样品中微生物种群的均匀性有所提高，导致数值略有上升。

表2 3个样品微生物群落丰富度和多样性指数Table 2 Community richness and diversity indices of 3 samples

2.4 微生物群落分布特征分析

2.4.1 细菌在门水平上的群落组成 3个样品微生物群落在门分类水平上的分布见图5，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、软壁菌门(Tenericutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)等五大门类是所有样品中的优势菌群，其相对丰度之和均占到土壤细菌总量的95%以上。随着堆肥的进行，微生物群落组成发生了明显变化。新鲜猪粪中各门优势度是厚壁菌门>拟杆菌门>软壁菌门>变形菌门>放线菌门，高温堆肥中则为厚壁菌门>放线菌门>变形菌门>软壁菌门>拟杆菌门，而腐熟堆肥中是放线菌门>厚壁菌门>变形菌门>软壁菌门>拟杆菌门，堆肥前后变化较大的是放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。新鲜猪粪中优势度最高的厚壁菌门，在堆肥高温阶段先略有增加，而在腐熟堆肥则剧降至18.18%；拟杆菌门和软壁菌门分别由23.53%和3.73%降至0.18%和0.31%；变形菌门和放线菌门经过堆肥后分别从1.64%和1.44%增加至4.01%和72.02%。

2.4.2 细菌在属水平上的群落组成 3个样品微生物群落在属分类水平上的分布见图6，共检测出36个细菌属，Turicibacter、Terrisporobacter、Parabacteroides、Clostridium_sensu_stricto_1、Halocella、Thermobifida、Thermomonospora、Thermopolyspora、Corynebacterium_1为优势菌属。由图6可知，经堆肥处理，猪粪微生物群落组成发生了明显变化。各样品优势菌属的统计结果如表3所示。新鲜猪粪中的Turicibacter、Terrisporobacter、Parabacteroides、Clostridium_sensu_stricto_1、Corynebacterium_1等来自动物肠道的微生物经堆肥后丰度下降，分别从22.74%、17.83%、15.70%、6.94%、1.22%降至0.10%、0.78%、0.00%、0.62%、0.00%，而热多孢菌属(Thermopolyspora)、热单孢菌属(Thermomonospora)、热双歧菌属(Thermobifida)和盐胞菌属(Halocella)则大幅增加，尤其是热多孢菌属和热单孢菌属的丰度分别达到32.74%和18.03%，成为腐熟堆肥中最主要的2个优势属。

图5 3 个样品微生物群落结构组成分布(门水平)Fig.5 Bacterial community composition at phylum level in 3 samples

图6 3个样品微生物群落结构组成分布(属水平，所占比例>1%)Fig.6 Bacterial community composition at genus level in 3 samples(>1%)

表3 3个样品中优势细菌菌落种属组成Table 3 Dominant genera in microbial communities from 3 samples

3 讨 论

堆肥过程中微生物群落组成和多样性均会发生明显变化[6-8]。本研究表明堆肥过程中微生物群落丰富度呈现降低的趋势，而多样性呈现先上升后下降的趋势，这与刘佳等[8]研究牛粪堆肥的结果一致。本研究中厚壁菌门、拟杆菌门、软壁菌门、变形菌门和放线菌门五大门类是所有样品中的优势菌群，这与其他研究结果[20-21]相似。在属水平变化上，新鲜猪粪中Turicibacter、Terrisporobacter、Parabacteroides、Clostridiumsensustricto、Corynebacterium等来自动物肠道的微生物经堆肥后丰度下降。狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto)菌从最初丰度6.94%到达高温阶段时增加至18.56%，但堆肥结束后，又剧减至0.62%。狭义梭菌属为厚壁菌门梭菌科的优势菌属，是一类能形成芽胞、厌氧生长的革兰阳性杆菌，广泛分布于土壤、堆肥、动物和人类的胃肠道中[22]。Franke-Whittle等[23]的研究已证明好氧堆肥中有局部的厌氧环境，因此狭义梭菌属菌在堆肥中占一定优势实属自然。而棒状杆菌属(Corynebacterium)从最初的1.22%，到高温阶段时增至15.05%，但堆肥结束又剧减至无，说明在堆肥后期阶段，该属菌优势逐渐被其他菌属所取代。放线菌(Actinobacteria)是堆肥腐熟度的一个标志，高温有助于放线菌的生存[24]。热双歧菌属(Thermobifida)、热单孢菌属(Thermomonospora)、热多孢菌属(Thermopolyspora)、棒状杆菌属(Corynebacterium)均为放线菌目。本研究中，经高温阶段后猪粪堆肥中Thermobifida、Thermomonospora、Thermopolyspora等具降解纤维素能力的放线菌比例大幅度增加，获得了高度的富集，丰度总和达到59.55%，成为丰度最高的优势菌，进一步说明堆肥已腐熟。整个堆肥过程中不同时间堆肥中细菌数量的变化恰恰是对它们生存环境改变的一种反应[25]。

本研究利用Illumina Miseq 高通量测序技术对新鲜猪粪、高温堆肥、腐熟堆肥3个样品16S rDNA V4～V5可变区序列进行测序，对猪粪堆肥过程中细菌群落组成和多样性变化进行了研究。研究发现在堆肥过程中微生物群落丰富度呈降低趋势，而多样性呈先略升后下降的趋势。同时，优势菌群会随着堆肥的进行而发生改变。这种变化正是微生物与堆肥的理化因子相互作用的结果。