鲁斌，俞广进，程敏

(1安徽医科大学附属巢湖医院，合肥 238000；2安徽医科大学第一附属医院)

我国是原发性肝癌高发的国家，每年新发病例约40万人，约占全球新确诊病例的一半左右，死亡人数超过30万，病死率高居第二位[1]。即使患者接受了外科手术、其他抗肿瘤手段结合的综合治疗方案，仍无法有效防止复发，直径5 cm以下的原发性肝癌患者术后3年的复发率超过50%[2]。上皮细胞-间充质转化(EMT)是指特定情况下上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程，一般认为能使上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得并增强迁移和侵袭能力[3]。锌指转录因子(Snail)、紧密连接蛋白(Claudin)-3是EMT相关的两种基因，在肝癌中的研究报道较少。2013年1月～2018年3月，我们观察了原发性肝癌组织中Snail、Claudin-3蛋白的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2016年6月安徽医科大学附属巢湖医院肝胆外科、安徽医科大学第一附属医院肝胆胰一病区行肝叶切除、肝段切除术的原发性肝细胞癌患者85例，男71例、女14例，年龄<65岁41例，65岁以上44例。均经病理科确诊为原发性肝癌，其中肿瘤直径<5 cm 70例，≥5 cm 15例；TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期51例，Ⅲ期30例；肿瘤微血管侵袭58例；肝硬化31例。纳入标准：①经病理科确诊为原发性肝癌；②患者病历、随访资料完整，组织蜡块标本保存完好；③未合并其他恶性肿瘤；③未合并其他影响免疫组化结果的严重疾病。手术中于肿瘤病灶中心切取肝癌组织，另切取相应距离肿瘤边缘5 cm以上非肿瘤组织中癌旁组织作为对照。本研究经医学伦理委员会批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 不同肝组织中Snail、Claudin-3蛋白表达检测 采用免疫组化法。将石蜡标本以4 μm间隔连续切片，常规脱蜡、水化。以3%H2O2浸泡孵育15 min，PBS冲洗3×3 min。在枸橼酸缓冲液中，于高温高压修复抗原约90 s，冷却后，PBS冲洗3×3 min。滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温放置20 min。滴加一抗(鼠抗人Snail单克隆抗体、鼠抗人Claudin-3单克隆抗体，均购自美国Santa Cruz公司)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3×3 min。滴加二抗(羊抗鼠IgG抗体，赛默飞世尔科技公司)，室温孵育30 min，PBS冲洗3×3 min。滴加链霉亲和素-生物素复合物，室温反应20 min，PBS冲洗3×3 min。……