张标金，陈庆隆，戴廷灿，周瑶敏，史华新，罗林广，魏益华，张祥喜

(江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，江西南昌330200)

硒(selenium,Se)是一种人体必需的微量营养元素，人体缺硒易引起生育率降低、免疫功能下降、克山病、大骨节病和增加癌症风险等多种生理健康问题[1-2]，已被世界卫生组织和中华医学会确定为21世纪继碘、锌后必补的第三大微量营养保健元素，但在全球居民中普遍摄入不足[3]。我国是缺硒比较严重的国家，全国土壤平均硒含量仅为0.29 mg/kg，有约70%的国土处于缺硒和低硒地区。我国成人的平均硒摄入量仅为26.63 μg/日，距离国家推荐的安全进硒量40～240 μg/(人·日)和美国推荐的安全进硒量50～200 μg/(人·日)都相差甚远。

水稻(OryzasativaL.)是我国半数居民的主粮，是人们膳食中硒的主要来源，因此利用天然富硒土壤生产出富硒稻米，从饮食方面增加人体摄硒量是一种比较理想的补硒途径，而阐明水稻积累硒的分子机制是富硒水稻生产的理论基础。土壤中的有效硒含量很低，主要取决于土壤水溶性硒含量，约占土壤全硒的1%～3%，主要包括亚硒酸盐、可溶性有机硒和硒酸盐[4]，而亚硒酸盐是稻田土壤中有效硒的主要存在形式。OsNIP2;1是水稻中的硅酸盐转运子[5]，也被鉴定发现具有吸收转运亚硒酸盐的功能[6]。

本研究利用GenBank数据库挖掘水稻OsNIP2;1及其家族其他成员、玉米ZmNIP和拟南芥AtNIP基因家族成员的氨基酸序列信息，分析氨基酸的理化性质与结构域特征，并评估3种植物NIP家族成员的亲缘关系，为揭示植物亚硒酸盐转运的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

从GenBank数据库检索获得水稻亚硒酸盐转运子OsNIP2;1的氨基酸序列，再以此为信息探针，在GenBank数据库选择非冗余蛋白质序列数据库开展blastp操作，分析检索获得OsNIP基因家族其他成员的氨基酸序列信息。此外，用同样的方法分别搜索获得玉米ZmNIP和拟南芥AtNIP的基因家族成员的氨基酸序列信息，用于分析其同源进化关系。OsNIP家族成员蛋白质的生理生化特征(包括氨基酸组成、相对分子质量、理论等电点及稳定性等)利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)软件分析。用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白质的亲/疏水性。分别用PSORT(http://www.psort.org/)和SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析亚细胞定位和蛋白信号肽。利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜结构域；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)预测OsNIP蛋白的二级结构。使用ClustalX2.1对家族所有成员的氨基酸序列进行比对，再利用MEGA7.0的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树[7]。

2 结果与分析

2.1 理化性质分析

水稻亚硒酸盐转运子OsNIP2;1的氨基酸序列全长为298 aa。经ProtParam tool对其理化性质的分析结果表明：OsNIP2;1蛋白的相对分子质量为31.978 ku，理论等电点pI为6.70，其分子式为C1448H2247N377O412S14。从氨基酸组成成分看，带负电荷的天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)总数为19，占6.38%，带正电荷的精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)总数为18，占6.04%；亲水性氨基酸数为102，占34.23%，疏水性氨基酸数为157，占52.68%。(表1，图1)。OsNIP2;1的不稳定性指数为30.77，该参数小于40，说明该蛋白的稳定性较好。蛋白的平均亲水性系数为0.379，脂溶指数为93.39，因此该蛋白属于疏水性蛋白。

水稻OsNIP基因家族共有10个成员，其氨基酸序列长度为273～311 aa，平均长度292.2 aa；平均理论等电点pI为7.57，最小值为5.62(OsNIP1;4)，最大值为9.08(OsNIP3;1)；10个OsNIP成员的蛋白平均相对分子质量为30.640，最小值为28.402(OsNIP1;4)，最大值为31.978(OsNIP2;1)(表2)。

表1 OsNIP2;1蛋白的氨基酸组成成分

*为疏水性氨基酸，#为亲水性氨基酸

* hydrophobic amino acids,# hydrophilic amino acid

图1 OsNIP2;1蛋白的亲/疏水性氨基酸分布情况Fig.1 Distribution of hydrophilic/ hydrophobic amino acids in OsNIP2;1 protein

2.2 蛋白结构分析

利用PSORT软件分析OsNIP2;1，发现该蛋白定位于细胞质膜中；再使用SignalP 4.1预测认为，该蛋白不包含信号肽(图2)。TMHMM分析结果表明，该蛋白包含6个跨膜结构域(图3)。进而采用SOPMA分析其二级结构分布情况，发现OsNIP2;1蛋白的二级结构由38.26%的α螺旋、21.48%的延伸带、10.40%的β转角和29.87%的随机卷曲等构成(图4)。

采用相关分析软件对OsNIP家族所有成员的蛋白结构进行分析的结果表明，10个成员的蛋白都定位于细胞质膜中；除了OsNIP1;3仅包含5个跨膜结构域外，其他成员都含有6个跨膜结构域；各成员蛋白的二级结构分布也相对一致，都以α螺旋和随机卷曲为主，两者之和约占总数70%(表3)。

表2 水稻OsNIP家族成员蛋白的基本信息

图3 OsNIP2;1蛋白的跨膜结构域Fig.3 Transmembrane domain of OsNIP2;1 protein

图4 OsNIP2;1蛋白的二级结构分布Fig.4 Distribution of the secondary structure of OsNIP2;1 protein

蛋白名称Protein name亚细胞定位Subcellular localization跨膜结构域数量Transmembrane domain number二级结构组成The secondary structure compositionα螺旋/%α helix延伸带/%Extended strandβ转角/%β turn随机卷曲/%Random coilOsNIP1;1细胞质膜636.2721.838.8033.10OsNIP1;2细胞质膜631.0224.4211.5533.00OsNIP1;3细胞质膜531.4725.8712.5930.07OsNIP1;4细胞质膜633.7021.6110.9933.70OsNIP2;1细胞质膜638.2621.4810.4029.87OsNIP2;2细胞质膜644.3022.825.7027.18OsNIP3;1细胞质膜625.4019.619.6545.34OsNIP3;2细胞质膜628.2022.628.8540.33OsNIP3;3细胞质膜636.6923.028.6331.65OsNIP4;1细胞质膜643.0123.0810.4923.43

2.3 OsNIP家族成员的同源关系分析

分别从GenBank数据库获得玉米ZmNIP成员和拟南芥AtNIP成员的氨基酸序列信息5和9条。采用ClustalX2.1对10个OsNIP基因家族成员的氨基酸序列进行同源性比对，分析结果表明其一致性系数达42.92%；再对水稻、玉米和拟南芥的所有NIP成员进行同源性比对，结果显示其一致性系数也高达40.56，可见NIP基因家族成员在同一植物中和不同植物间都具有很高的同源性。在进化过程中，有部分氨基酸表现出高度的保守性，这些氨基酸可能是该蛋白行使生物学功能的关键氨基酸(图5)。利用MEGA7.0对水稻、玉米和拟南芥的NIP成员构建起系统进化树，发现3种植物的24个成员可划分成4个亚族(图6)。

图5 水稻、玉米和拟南芥NIP基因家族成员的氨基酸序列比对Fig.5 Amino acid sequences alignment for members of the OsNIP gene family from rice,maize and arabidopsis

3 讨论

图6 水稻、玉米和拟南芥的OsNIP基因家族成员同源进化树Fig.6 Homologous evolution tree of the OsNIP gene family members from rice,maize and arabidopsis

水稻OsNIP家族包含了10个成员，目前除了已鉴定发现OsNIP2;1有转运硅酸盐[5]、亚硒酸盐[6]、亚砷酸盐[8-9]的功能，OsNIP2;2[10]和OsNIP3;2[11]能够积累亚砷酸盐， OsNIP3;3具有转运水、过氧化氢、亚砷酸盐等多种底物[12]的能力外，其他大部分成员的生物学功能尚不清楚。因此，利用生物信息学的方法，通过对亚硒酸盐转运子OsNIP2;1的结构特点进行鉴定，寻找潜在的类似功能蛋白是一条重要途径。从本研究的结果来看，水稻OsNIP家族成员的结构高度相似，甚至与玉米、拟南芥等植物NIP家族间的进化关系都高度保守，因此，可以推测认为植物NIP家族转运蛋白的底物应该具有很高的相似性。如，研究发现拟南芥AtNIP7;1[13]也具有转运亚砷酸盐的功能，与水稻中多个同源蛋白的生物学功能一致；玉米ZmNIP2;1,ZmNIP2;4[14]和水稻OsNIP2;1[5]都能够转运尿素。因此，随着更多NIP家族成员功能的鉴定，可能将会有更多的亚硒酸盐转运子被发现，进一步丰富水稻乃至植物中的硒转运分子机制。

Zhao等[6]在酵母中表达OsNIP2;1时发现，在偏酸性条件下，OsNIP2;1可促进亚硒酸盐的吸收；但是在偏碱性条件下，OsNIP2;1对亚硒酸盐的吸收能力没有明显变化。亚硒酸是弱酸，在不同的pH条件下，表现出不同的化学形态，在酸性条件下，H2SeO3是主要存在形式，因此，OsNIP2;1可能主要以H2SeO3形式转运亚硒酸盐。此外，人们还发现植物一些磷酸盐转运蛋白也能够参与亚硒酸盐的转运[15-17]。因此，可能植物中亚硒酸盐的吸收途径多样，但当前其吸收、转运、甚至外排等的分子机制都还了解甚少，这有待于进一步开展相关基因的挖掘工作，为全面阐明植物的富硒机理，培育富硒粮食作物满足人们的硒营养需求提供理论基础。

OsNIP2;1是水稻中发现的第一个亚硒酸盐转运子，主要在水稻根末梢的外皮层和内皮层中表达[18]，在水稻硒的吸收中发挥了重要作用。我国是严重缺硒的国家，通过主粮的硒营养强化提高人们膳食的硒摄入量是预防硒缺乏疾病的根本出路[19]。作物的聚硒能力与作物种类、品种类型等都有关。水稻是聚硒能力较弱的作物种类之一，但品种间表现出较大的差异性[20]，这主要取决于品种的遗传基因结构。因此，OsNIP2;1的发现可为采用生物技术方法提高水稻聚硒能力，培育富硒稻米提供良好的理论基础。此外，通过对OsNIP2;1表达模式、调控网络等的深入研究，可为水稻硒吸收、迁移与转化等机制的研究提供切入点。