方慧瑾李 燕吴 巍祝宇杰郑 智

（1 上饶市人民医院药剂科，江西 上饶 334000；2 铅山县人民医院药剂科，江西 上饶 334000；3 上饶市健康教育所，江西 上饶 334000；4 江西省肿瘤医院肿瘤科，江西 南昌 330029）

夏至草是唇形科夏至草属植物夏至草lagopsis supine（steph）IK.Gal.的全草[1]，是我国一种传统中草药。目前，国内外已经从夏至草中分离得到的化合物有三萜类、甾体及其皂苷、黄酮及黄酮苷类、苯丙素苷类、生物碱类等[2-3]。据文献报道生物碱、黄酮类、苯乙醇类、二萜类化合物及五环三萜类化合物等具有抗肿瘤活性[4-5]，且芹菜素可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡而抑制多种恶性肿瘤 （食管癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌等）细胞的生长，并且具有天然、低毒、高效的特点[6]。以往对夏至草化学成分的研究发现[3]，夏至草富含黄酮苷，特别是芹菜素苷。故本研究评价了夏至草乙醇提取物对结肠癌细胞HCT-116细胞的增殖抑制及促进凋亡等作用效果。

1 材料与方法

1.1 药物及细胞株 药材：2015年5月采集于北京天坛公园的夏至草，于通风处自然晾干。由中国药物生物制品检定所鉴定为夏至草（lagopsis supine （steph）IK.Gal.）。取干燥夏至草适量，适度粉碎，加入18倍量95%乙醇提取2次，第1次加热前浸泡6 h，以上提取均为油浴110℃回流提取，乙醇沸腾后2 h，合并两次提取液，减压回收溶剂至无醇味，得浸膏。所得浸膏用蒸馏水稀释，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，以上萃取体积均为水相∶有机溶剂等于1∶1，所得有机萃取层减压回收溶剂后，合并氯仿、乙酸乙酯和正丁醇层萃取物浸膏共2.8 g置于冰箱2～8℃保存备用。人结肠癌HCT-116细胞由上海交大第十人民医院提供。

1.2 主要试剂与仪器 RPMI-1640培养基和胎牛血清（FCS），GIBICO公司；CCK-8试剂盒，日本同仁公司；无菌PBS水溶液，自制；全自动酶标仪450，Bio-Rad公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒，Centre-bio产品；流式细胞仪 （FACS）Calibur E4242，Bio-Rad公司；CO2培养箱BB5060，Heraeus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 HCT-116细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、含5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养，2～3 d以1∶3的比例传代1次。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3.2 细胞增殖抑制实验 取处于对数生长期的人结肠癌HCT-116细胞，接种于96孔板，每孔100 μL共计1×104个细胞，置于37℃，5%CO2条件下恒温培养箱培养24 h，待细胞贴壁后加入含有不同浓度的夏至草乙醇提取物溶液20 μL （1500 g/mL、750 μg/mL、375 μg/mL、300 μg/ml、60 μg/mL） 并设阴性对照孔，每个处理组均设3个复孔，以上细胞分别培养24 h和培养44 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态，并用无菌的PBS清洗后加入10 μL CCK-8培养2 h，在全自动酶标仪上570 nm长处读取吸光度 （OD）值。取3孔OD值的均数，按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率 （%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.3.3 细胞凋亡实验 取处于对数生长期的人结肠癌HCT-116细胞，接种于6孔培养板，每孔1 mL共计2×105个细胞，分别加入300 μg/mL的夏至草的含药学清和空白血清各200 μL，培养96 h后，消化，收集细胞，每组2×105个细胞，1000 r/min离心 5 min，弃上清。用PBS洗2次，1000 r/min 离心5 min。用200 μL的1×孵育缓冲液 （Binding buffer）重悬细胞。分别加入10 μL AnnexinV-FITC 和 10 μL碘化丙啶 （Propidium Iodide），4℃下孵育25～30 min，避光并振动。加入300 μL 1×孵育缓冲液重悬细胞，采用 AnnexinVFITC/PI双染后，通过流式细胞仪 （FACS）检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.4 统计学方法 各分组所得计量数据采用均数±标准差 （±s）表示，应用SPSS 17.0软件进行统计学处理，应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组间均数比较采用 t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有统计学显著性。

2 结果

2.1 夏至草提取物对细胞增殖的影响 表1示，与空白对照组比较，高浓度组夏至草溶液 （1500 μg/mL、750 μg/mL）和中浓度组夏至草溶液 （375 μg/mL、300 μg/mL）OD值均明显降低 （P＜0.01或P＜0.05），且高浓度组有显著性的统计学差异。高浓度组 （1500 μg/mL）与各浓度组间有显著的统计学差异 （P＜0.01），而其他各浓度组间无统计学差异 （P＞0.05）。不同作用时间的各浓度组之间存在显著性差异 （P＜0.01）。

表1 不同浓度夏至草乙醇提取物溶液对人结肠癌HCT-116细胞的增殖影响

2.2 夏至草乙醇提取物对细胞凋亡的影响 表2示，夏至草高、中、低浓度组的细胞凋亡率均高于对照组，但组间无统计学差异 （P＞0.05）；且夏至草高、中、低浓度组间比较，夏至草高浓度组细胞凋亡率最高，但两两比较，差异均无统计学意义 （P＞0.05）。

表2 各组人结肠癌HCT-116细胞凋亡情况比较 （%）

3 讨论

结肠癌是消化系统中最为常见的恶性肿瘤之一。在美国，结直肠癌发病率占所有癌症的第4位，而死亡率为第2位[7]。我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势。2015中国癌症统计数据显示：我国结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5位，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万[8]。从中医学方面来看，尤其是晚期结肠癌，痰、瘀是其主要的病理特征[9]，夏至草味辛、微苦，性寒，归肝经，有养血活血、清热、利湿的功效[10]。研究者[11]发现一种含有夏至草的方剂可以降低肿瘤化疗引起的不良反应。既往研究发现夏至草富含黄酮苷[3]，黄酮类化合物抗肿瘤活性明显，但是关于夏至草抗肿瘤活性研究目前没有报道，故本研究考察了夏至草乙醇提取物对人结肠癌HCT-116细胞的增殖和凋亡的影响。

本研究的细胞凋亡试验结果显示，夏至草乙醇提取物高、中、低浓度组的细胞凋亡率均高于对照组，但组间无统计学差异 （P＞0.05）；且高、中、低浓度组组间比较，高浓度组细胞凋亡率最高，但两两比较差异均无统计学意义 （P＞0.05）。从研究结果看，夏至草对人结肠癌HCT-116细胞凋亡作用不明显。

本研究的细胞增殖抑制实验结果显示，不同浓度的夏至草乙醇提取物对人结肠癌HCT-116细胞的增殖有明显的抑制作用，浓度为1500 μg/mL的夏至草提取物抑制作用最强，作用24 h和44 h的细胞抑制率分别是51.4%和57.8%，与对照组和各浓度组之间具有显著性差异 （P＜0.01），说明乙醇夏至草提取对人结肠癌HCT-116细胞的增殖存在浓度时间依赖性。从研究结果看，浓度为1500 μg/mL的夏至草提取物抑制人结肠癌HCT-116细胞增殖作用最佳，但抑制细胞增殖的作用机制还有待进一步研究。