松花粉对红白锦鲤生长性能、消化及非特异性免疫力的影响

2018-11-20朱浩然张宝龙朱国霞高微微白东清

江苏农业科学 2018年20期

朱浩然，刘芳，张宝龙，杨广，王洋，朱国霞，高微微，白东清

(1.天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384； 2.天津现代晨辉科技集团有限公司天津市水族动物功能性饲料企业重点实验室，天津 301800)

锦鲤(Cyprinuscarpiovar.koi)在生物学上属于鲤形目鲤科(Cyprinidae)，是名贵观赏鱼品种之一。锦鲤是一种高档观赏鱼，已在全世界风靡，有“水中活宝石”“会游泳的艺术品”的美称。其中，以红白锦鲤为代表种，但红白锦鲤属于近亲繁殖，自身免疫力低下，易感染疾病，从而降低了观赏价值。因此，开发一种新的免疫增强剂，提高其生长性能、消化能力及非特异性免疫力是观赏渔业发展过程中的研究难点。

松花粉(pollenpini)是松科植物马尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PihustabulaefermisCarr.)或同属数种植物的干燥花粉，有止血的功效[1]，且几乎无毒[2]。松花粉具有提高抗氧化能力、增强身体免疫功能、延缓衰老[3-4]等作用，松花粉中所含微量元素、黄酮类、维生素E及胡萝卜素等，均有清除体内自由基作用[5]，可提高机体抗氧化酶类的活性，抑制脂质过氧化反应。松花粉含有丰富多糖，已有大量试验表明，多糖能有效消除自由基，提高机体抗氧化能力[6-7]。松花粉大多用作人体保健品，作为动物免疫增强剂的研究较少，在水产方面还未见报道。鉴于此，本试验选取红白锦鲤为研究对象，在饲料中添加不同含量水平的松花粉，研究其对红白锦鲤的生长性能、消化酶活力、非特异性免疫能力的影响，探索红白锦鲤饲料添加松花粉的最适水平，为水产动物免疫增强剂的开发提供一定理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验鱼试验用鱼购自天津现代晨辉科技集团有限公司，均为同批次健康且规格一致的红白锦鲤，初始体质量为(8.14±1.56) g，初始体长为(7.84±0.33) cm。

1.1.2 试验试剂试验用配合饲料购自天津市晨辉饲料有限公司，饲料营养成分：粗蛋白含量为40.11%，粗脂肪含量为11.15%，粗灰分含量为9.67%，水分含量为5.79%，钙含量为2.57%，磷含量为0.29%。

松花粉为烟台新时代健康食品有限公司生产的国珍破壁松花粉(含粗多糖16.20 mg/g)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验鱼分组及管理将540尾试验用鱼在天津现代晨辉科技集团有限公司的养殖池中暂养1周后进行分组，随机分配到18个网箱(1 m×1 m×1 m)中，每6个网箱放置于1个养殖池(2.25 m×2.25 m×0.70 m)内，标记为S1～S6，每组3个重复，每个重复30尾鱼，每日投喂2次(08：00、16：00)，投喂率为3%，每2 d换水1/5，每7 d刷池子1次。饲养时间为2017年7—10月。

1.2.2 饲料配制及饲养管理在基础饲料中添加不同含量水平(0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)的松花粉，添加不同含量水平(3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%)次粉，每组均加入0.5%大蒜素，配制成6种饲料，记为S1～S6。饲料粉末用80目筛进行过筛，混合均匀，用饲料颗粒机将混合好的饲料制成粒径大约为2.00 mm的沉性颗粒饲料，放在通风、阴凉处晾干。

1.2.3 样本采集养殖30 d后，禁食48 h，测量各组鱼的体质量、体长，计算增质量率、特定生长率、蛋白质效率及饵料系数，解剖鱼体，将采集的肝胰脏、脾、头肾、中肾、脑、鳃组织分别放进自封袋(整个过程在冰袋上操作以保持组织新鲜)，冻存于-80 ℃冰箱。组织测定前用匀浆机在冰浴条件下研磨，各组织与盐水体积比1 ∶9浸入生理盐水(0.85%)，将匀浆液倒入离心管中，于4 ℃、3 500 r/min条件下离心10 min后，吸取上清液转移到新离心管中，再进行各指标的测定。

1.2.4 生长指标测定生长试验开始和结束时，测量各组鱼的体质量、体长，计算增质量率、特定生长率、饵料系数及蛋白质效率。

增质量率(WG)=(Wt-W0)/W0×100%；特定生长率(SGR)=[ln(Wt)-ln(W0)]/t×100%；蛋白质效率(PER)=(Wt-W0)/(Id×Pd)；饲料系数(FCR)=Id/(Wt-W0)。

式中：Wt为末期鱼体质量(g)；W0为初始鱼体质量(g)；L为试验末鱼体长(cm)；Id为摄食总量(g)；Pd为饲料中蛋白含量(g)；t为饲养时间(d)。

1.2.5 非特异性免疫指标测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)活性、丙二醛(malonaldehyde，简称MDA)含量、过氧化氢酶(catalase，简称CAT)活性、谷胱甘肽(glutathione，简称GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，简称GSH-PX)活性、一氧化氮(NO)含量等指标均采用南京建成生物科技有限公司的试剂盒测定。

1.2.6 消化酶测定脂肪酶(lipase，简称LPS)、淀粉酶(amylase，简称AMS)活性等指标均采用南京建成生物科技公司的试剂盒测定。蛋白酶测定采用福林酚法。

1.2.7 数据分析与统计试验数据均为平均值±标准差，采用SPSS 16.0进行分析，试验结果用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行数据处理，差异显著时用邓肯氏多重比较(Duncan’s multiple range tests)法进行平均值的多重比较。

2 结果与分析

2.1 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤生长性能及饲料利用率的影响

养殖1个月后，饲料中不同水平松花粉明显影响红白锦鲤的生长性能和饵料系数。由表1可知，S5组锦鲤末期平均体质量显著高于其他组。各组的增质量率、蛋白质效率等指标随着松花粉含量水平的增加整体呈先上升后下降的趋势，且S1组最低，其中S5组增质量率、特定生长率和蛋白质效率显著高于其他组。饵料系数随着松花粉含量水平的增加呈先下降后上升的趋势，试验组各项指标均低于S1组。S4～S6组饵料系数显著低于对照组，饵料系数最低值出现在S5组，比S1组降低49.02%。

表1 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤生长指标和饲料利用率的影响

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下表同。

2.2 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤非特异性免疫力的影响

2.2.1 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中SOD活性的影响由表2可知，养殖1个月后，在红白锦鲤肝胰脏、脾脏、中肾、头肾、脑、和鳃中SOD活性最强的器官是肝胰脏。各试验组红白锦鲤体内SOD活性均大于S1组，在肝胰脏中，SOD活性最高值出现在S3组，是S1组的2.29倍，S2、S4、S5、S6组SOD活性分别是S1组的1.89、1.23、1.61、1.54倍；S2、S5组中肾中SOD活性明显提升，分别是S1组的1.09、1.17倍。S2～S6组脑中SOD活性明显提升，均显著高于S1组，各组SOD活性分别是S1组的2.76、3.15、3.45、3.33、2.34倍。S4组鳃中SOD活性显著高于S1、S2、S3、S6组，分别是S1、S2、S3、S6组的2.21、2.16、1.98、2.01倍。松花粉对红白锦鲤脾脏、头肾的SOD活性影响不大。

2.2.2 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中CAT活性的影响由表3可知，随着松花粉含量水平的增加，各组组织中CAT活性呈现先上升后下降的趋势。对照组(S1组)CAT活性排序为肝胰脏>头肾>中肾>鳃>脑>脾脏。S5组肝胰脏CAT活性显著高于其他组，是S1组的 1.66 倍，且其他组间差异不显著。S4、S5组脾脏CAT活性显著高于S1组，分别为S1组的3.85、3.93倍，且S5组CAT活性最高。S2～S6组头肾的CAT活性显著高于S1组，分别是S1组的2.82、3.11、3.29、3.81、2.30倍。S4组中肾CAT活性显著高于S1组，是S1组的1.55倍。S2、S3组脑中CAT活性显著高于S1组，分别是S1组的6.14、9.94倍。S3组鳃CAT活性明显高于S1组，是S1组的3.00倍。

表2 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中SOD活性的影响

表3 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中CAT活性的影响

2.2.3 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中MDA含量的影响由表4可知，随着松花粉含量水平的增加，各组组织中MDA含量整体呈先下降后上升的趋势，且各试验组MDA含量均低于对照组。S1组各组织中MDA含量由高到低依次为脑>头肾>肝胰脏>脾脏>鳃>中肾。与S1组相比，S2～S5组肝胰脏中MDA含量显著降低，比S1组分别降低了69.53%、70.35%、82.31%、86.40%；S3～S6组的脾脏中MDA含量显著下降，最低值出现在S4组，比对照组降低38.07%；S5组头肾中MDA含量比对照组低93.20%；S3组中肾MDA含量比对照组下降46.46%；各组脑、鳃中MDA含量变化不大，但最低值均出现在S5组。

表4 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织MDA含量的影响

2.2.4 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中GSH含量的影响由表5可知，在红白锦鲤肝胰脏、头肾、中肾、脑、脾脏和鳃中，GSH含量最高的组织是肝胰脏，且各添加组组织中GSH含量均高于对照组。S5组肝胰脏中GSH含量显著高于其他各组，分别是其他各组的3.03、2.52、1.80、1.60、2.41 倍；与S1组相比，S5组头肾中GSH含量显著提高；S5、S6组中肾中GSH含量显著增加；S4组脑中GSH含量比对照组提高了4.55倍；各组脾脏、鳃中GSH含量最大值均出现在S4组，分别比对照组提高了4.15、1.42倍，但各组均无显著差异。

表5 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中GSH含量的影响

2.2.5 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中 GSH-PX 活性的影响由表6可知，各试验组组织中GSH-PX活性整体高于对照组，对照组GSH-PX活性由高到低依次为肝胰脏>头肾>脾脏>中肾>脑>鳃。S4、S5组脾脏与S3～S6头肾中GSH-PX活性均显著高于对照组，分别比S1组提高 10.36%～17.29%、116.57%～240.57%；S3、S4组中肾GSH-PX活性显著高于对照组和其他各试验组(P<0.05)，其中S4组活性比对照组提高 1.37 倍；S3～S5组脑中GSH-PX活性比S1组提高1.53～4.31倍(P<0.05)，且显著高于S1、S2、S6组；投喂含松花粉的饲料30 d对肝胰脏、鳃中GSH-PX活性影响不大。可见，S3～S6处理均在不同程度上提高了组织中GSH-PX活性。

2.2.6 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中NO含量的影响由表7可知，饲料中添加松花粉对红白锦鲤头肾、脑、鳃中NO含量均无明显影响。S3组肝胰脏中NO含量显著高于其他组；S3～S6组脾脏中NO含量均显著高于S1、S2组，其中含量最高组出现在S5组，为对照组的2.11倍。S5组中肾中NO含量显著高于S1、S2、S4组。

表6 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中GSH-PX活性的影响

表7 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤组织中NO含量的影响

2.3 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤肠道消化酶活性的影响

2.3.1 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤肠道脂肪酶活性的影响由表8可知，试验组前肠、中肠、后肠的脂肪酶活性呈先上升后下降的趋势，对照组脂肪酶活性排序为中肠>前肠>后肠。S4组前肠的脂肪酶活性显著高于对照组，比对照组提高了1.07倍；中肠、后肠脂肪酶活性变化不明显。

表8 松花粉对锦鲤肠道脂肪酶活性的影响

2.3.2 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤肠道淀粉酶活性的影响由表9可知，试验组的前肠、中肠、后肠的淀粉酶活性整体呈先上升后下降的趋势。松花粉对前肠淀粉酶活性影响不大；S5组中肠淀粉酶活性显著高于其他各组，比S1组提高了70.33%；S4组后肠淀粉酶活性显著高于对照组，且S4组提高最大，比对照组提高了3.80倍。

表9 松花粉对锦鲤肠道淀粉酶活性的影响

2.3.3 饲料中不同含量水平松花粉对红白锦鲤肠道蛋白酶活性的影响由表10可知，试验组的前肠、中肠、后肠的蛋白酶活性基本上均高于对照组，且后肠蛋白酶活性最高。S3、S4、S6组前肠蛋白酶活性显著高于S1、S2组；S3～S6组中肠蛋白酶活性显著高于S1组，最高值出现在S5组，比S1组高1.62倍。各组后肠蛋白酶活性变化不大。

表10 松花粉对锦鲤肠道蛋白酶活性的影响

3 讨论

3.1 饲料中添加松花粉对红白锦鲤生长性能及饲料利用率的影响

在本试验条件下，松花粉添加水平在2.0%时，增质量率、特定生长率、蛋白质效率显著高于对照组，饵料系数显著降低，说明饲料中添加松花粉可以在一定程度上促进红白锦鲤的生长性能，提高饲料利用率。松花粉具有丰富的多糖，可以促进动物生长，与中药多糖在生长中的作用结论类似，如吴旋用4种中药多糖，可促进黄颡鱼生长增质量、降低饵料系数[8]。同时，松花粉中含有多种氨基酸、常量及微量矿物元素与维生素等营养成分，尤其是松花粉中含有丰富的类胡萝卜素。白东清等发现，1.0 g/kgβ-胡萝卜素组红白锦鲤的增长率、增质量率、特定增长率显著高于对照组，1.0～2.5 g/kg组的饵料系数均显著低于对照组[4]，与本试验结果相似。

3.2 饲料中添加松花粉对红白锦鲤非特异性免疫的影响

抗氧化能力主要是由超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及丙二醛来综合反映的。SOD是鱼体内氧化的关键酶，能消除鱼体在新陈代谢过程中产生的有害物质，其活性的高低可以反映抗氧化系统氧自由基清除机制的高低和体内氧自由基水平的高低。SOD活性的升高促使SOD催化分解超氧阴离子，从而在一定程度上保护细胞免受氧自由基的损害，在修复受损细胞上也有一定作用[9]。CAT的作用是分解H2O2生成O2和H2O，保护细胞免受损伤[10]。MDA是脂质过氧化作用的最终产物，其含量可以间接反映机体的活性氧自由基和脂质的过氧化水平[11]。还原型谷胱甘肽是机体内最重要的非酶型抗氧化物，具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持细胞的正常生长发育及细胞免疫等多种重要生理功能。谷胱甘肽过氧化酶可以促进GSH反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽。本试验结果表明，松花粉在一定程度上可以有效提高红白锦鲤鱼体抗氧化能力，表现在提高SOD、CAT、GSH-PX活性，使鱼体内GSH含量升高，降低MDA含量。

中医衰老说的药理试验证明，松花粉中含有大量抗氧化物质，如维生素E、胡萝卜素及微量元素硒，可以抑制体内脂肪和蛋白质氧化反应。同时近期的研究表明，松花粉具有提高抗氧化能力、增强免疫功能等功效[12]。此外，松花粉含有酶、黄酮、多肽等生理活性物质。已有大量研究表明，黄酮可以有效清除自由基，提高抗氧化活力：周晓丽等利用体外试验检测发现，木瓜黄酮对DPPH自由基有清除作用[13]。王芳等发现，桑叶黄酮对DPPH自由基也有显著的清除作用[14]。本试验结果表明，不同水平松花粉对组织的CAT活性、MDA含量、SOD活性、GSH含量、GHS-PX活性有显著影响，说明松花粉可有效清除自由基。可见，松花粉可将多种超氧化物、过氧化物、氧化物等自由基分解或还原，从而起到抗氧化、提高免疫力的作用。张暾等发现，破壁松花粉对小鼠免疫有调节功能[15]。回晶等研究发现，松花粉黄酮提取物对超氧阴离子自由基有良好清除能力，表明松花粉黄酮提取物具有良好的体外抗氧化作用[16]。赵立新等发现，用含松花粉的饲料投喂小鼠，结果表明松花粉能明显增加衰老小鼠血清中SOD活性、CAT活性、GSH-PX活性，降低脑组织中MDA含量[17]。以上研究成果与本试验结果基本相吻合，值得注意的是本试验中松花粉对脑中MDA含量变化影响不显著，但各试验组MDA含量均低于对照组，这可能与养殖对象、抗氧化剂和组织沉积部位有关。

本研究结果表明，随着松花粉含量水平的增高，鱼体内各组织SOD、CAT活性均提高，且各组织的CAT活性均高于对照组；肝胰脏、中肾、脑、鳃的SOD活性均较对照组有明显提升，试验组头肾、脾脏SOD活性与对照组差异不显著；肝胰脏、脾脏、头肾、中肾的MDA含量均明显低于对照组，而脑、鳃降低不显著。此结果说明，松花粉可以提高锦鲤鱼体抗氧化酶活性和促进还原性物质的生成。

添加松花粉后，红白锦鲤肝胰脏、头肾、中肾、脑的GSH含量明显提升，脾脏、鳃提升不显著；部分处理脾脏、头肾、中肾、脑的GSH-PX活性显著高于对照组；头肾、中肾、脑中GSH含量、GSH-PX活性呈正相关。GSH-PX的主要生理功能是催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而维持机体内环境稳定[18]。由于该指标在各个组织的含量分布不同，所以其调控机制还须要深入研究。

一氧化氮(即血管内皮舒张因子)在鱼体内作为一种反应性极强的自由基，具有广泛的生理作用，如免疫调节。本研究结果表明，肝胰脏、脾脏、中肾中NO含量有明显变化，脑、鳃、头肾中NO含量变化不明显。NO产生异常与某些疾病发生发展有着密切的关系，但是NO的免疫调节影响还须要进一步探讨。

3.3 饲料中添加松花粉对红白锦鲤肠道消化酶的影响

肠道是锦鲤的消化吸收器官，其对鱼类来说尤其重要，红白锦鲤无胃，对营养物质的消化和吸收只能通过肠道。消化酶是消化系统分泌的具有催化食物分解作用的一类酶，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶是红白锦鲤肠道中较重要的消化酶。消化酶活性的大小直接影响鱼体对食物中营养物质的消化吸收，从而对鱼类的生长具有重要作用[19-20]。

松花粉富含多种营养成分和生物活性物质，其中的维生素B1可以促进肠道蠕动，增强消化功能，张玉英等观察发现，投喂黑松花粉可以使豚鼠结肠、小肠平滑肌活动加强，增加豚鼠肠道双歧杆菌数量[21]。赵霖等在家猪饲料中添加3.5%松花粉，发现松花粉饲料显著增加了家猪粪便中甘油三酯、胆固醇、脂肪酸及胆酸的排泄量[22]。本试验对锦鲤的前肠、中肠、后肠进行了消化酶测定，结果表明，试验组的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性对比对照组均有所提升，1.0%～2.0%水平的松花粉添加组效果较好，说明松花粉对锦鲤肠道的消化有促进作用，且松花粉添加量在1.0%～2.0%时，中肠的脂肪酶、淀粉酶含量均高于前肠、后肠。这可能与松花粉含有的促消化的特殊营养成分，例如维生素E、胡萝卜素等有关。罗辉试验表明，幼建鲤肠道皱襞高度受到饲料中维生素E的影响，维生素E通过抗氧化作用保护肠道细胞的结构完整和膜的流动[23]。同时，有关松花粉对观赏鱼肠道影响的研究还很少，有待于深入研究。