尹向田， 杨 阳

(山东省葡萄研究院，山东济南 250100)

2010年Madhaiyan等自水稻根系土壤中分离得到甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，首次明确为新种，并研究发现该菌具有促进植物生长的作用[1]。吕倩等从深海特殊生境下分离筛选到具有较强抗病原真菌活性的甲基营养型芽孢杆菌，并分离纯化得到3个主要抗真菌脂肽活性物质，具有较强的抑制黄瓜炭疽病菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎病等植物病原真菌的活性，具有防治作物真菌病害的研发价值[2]。

芽孢杆菌通过分泌一些次生代谢产物来抑制病原菌的生长是芽孢杆菌作用于病原菌的重要机制[3]。自1952年Babard等从枯草芽孢杆菌培养液中分离出抗真菌肽以来，不断有新的拮抗物质被发现[4]。正是由于具有强大合成抗生物质的能力，离体条件下芽孢杆菌能对多种不同类型的植物病原菌表现出很强的拮抗效果[5]。

甲基营养型芽孢杆菌GSBM05是由笔者所在实验室在葡萄园根际土壤中分离得到的菌株，初步试验表明，该菌株对葡萄炭疽病病菌、葡萄溃疡病病菌、葡萄白腐病病菌等多种葡萄种植中常见的病害均具有良好的生防活性。关于甲基营养型芽孢杆菌发酵条件优化的报道中，有产氨肽酶、产果聚糖蔗糖酶、产3-羟基丁酮等的发酵条件优化[6-8]，但对于甲基营养型芽孢杆菌产抗菌物质发酵条件优化的研究极少，因此，有必要对菌株GSBM05的发酵特性进行深入研究。本研究以葡萄白腐病病菌为靶标，主要以提高抗菌活性物质产量为目的，优化该菌株的最佳发酵条件，以期为该菌株抗菌物质的进一步分离及生防菌剂的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 甲基营养型芽孢杆菌GSBM05菌株、葡萄白腐病病菌，均由山东省葡萄研究院良种与栽培研究所保存。

1.1.2 供试培养基 NA培养基：3 g牛肉浸膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，15 g琼脂，调节pH值至7.0，定容至1 000 mL。121 ℃ 灭菌20 min，用于GSBM05菌株斜面培养与活化；NB培养基：在NA培养基的基础上去掉琼脂，用于GSBM05菌株种子液培养；PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，1 000 mL水，pH值自然，用于真菌的培养。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液的制备 菌株GSBM05于NA培养基上活化后接于装有100 mL NB培养液的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min振荡培养24 h。

1.2.2 测定内容及方法 菌体生物量测定方法：将菌株GSBM05发酵液原液用0.85%生理盐水稀释5倍，用721型分光光度计在600 nm波长下测定其D600 nm。

抑菌活性检测方法：将菌株GSBM05发酵液在4 ℃、10 000 r/min 条件下离心15 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤得无菌发酵液。刮取在PDA培养基上培养7 d的葡萄白腐病病菌孢子，配成浓度为107个孢子/mL的悬浮液，将孢子悬浮液与PDA培养基以1 ∶50的体积比混匀后倒平板，凝固后在培养皿中间用直径为7 mm的打孔器(已灭菌)打孔，加入60 μL菌株GSBM05发酵液，3 d后测量抑菌圈直径。

1.2.3 发酵培养基成分优化 碳源的筛选：在NB培养基中分别添加1%乳糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉、柠檬酸、麦芽糖、蔗糖、麦芽浸膏、甘油、玉米粉、燕麦粉等作为NB培养基中的碳源，其他成分不变。以5%的接种量将种子液分别接种到装有100 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，在 28 ℃、180 r/min条件下培养48 h，测定其D600 nm和抑菌活性，每个处理3次重复。

氮源的筛选：分别以1%蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2SO4、NH4Cl、胰蛋白胨、豆粕、大豆粉等代替NB培养基中的氮源，其他操作同碳源的筛选，每个处理3次重复。

无机盐的筛选：分别以0.5% NaCl、CuSO4、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeSO4、CaNO3、K2HPO4、CaCO3等代替NB培养基中的无机盐，其他操作同碳源的筛选，每个处理3次重复。

多因素正交试验：以单因子试验筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐为变异因素，采用L16(45)正交表进行培养基优化试验，确定培养基各组分的最佳配比。

1.2.4 菌株发酵条件的优化 以优化后的培养基为发酵培养基，对GSBM05菌株装液量、接种量、初始pH值、发酵时间、温度、转速等发酵条件进行优化。装液量分别为30、60、90、120、150 mL/250 mL三角瓶；接种量分别为装液量的2%、4%、6%、8%、10%、12%；初始pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；发酵时间分别为24、36、48、60、72、84、96、120 h；温度分别为20、24、28、30、32、36、40 ℃；转速分别为90、120、150、180、220 r/min。每个处理3次重复。

1.2.5 优化培养条件与原始条件防效对比 用筛选出来的发酵优化培养基成分和培养条件对GSBM05菌株进行发酵培养，以原始发酵条件为对照，对比所产抗菌活性物质对葡萄白腐病病菌的抑菌圈大小。

1.3 菌株GSBM05发酵液抑菌活性稳定性的测定

温度稳定性：将无菌发酵液分别置于40、60、80、100、120 ℃ 温度下处理30 min，测定其对葡萄白腐病病菌的抑菌活性。

pH值稳定性：室温下用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH溶液将菌株GSBM05发酵液的pH值分别调至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，静置 4 h，再依次将各pH值调回7.0，测定其对葡萄白腐病病菌的抑菌活性。

紫外稳定性：将无菌发酵液分别在紫外灯下照射0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h后，测定其对葡萄白腐病病菌的抑菌活性。

1.4 数据统计与分析

试验数据用DPS软件进行差异显著性分析，用Microsoft Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基成分优化

2.1.1 不同碳源对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图1可知，不同碳源对菌株GSBM05代谢抑菌活性物质有显著影响，以柠檬酸为碳源的发酵液抑菌圈直径及D600 nm均为最小值，而以可溶性淀粉为碳源的发酵液抑菌圈直径为最大值，为15.5 mm，且此时的D600 nm也较大。因此，选用淀粉为培养基碳源。

2.1.2 不同氮源对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图2可知，以淀粉为固定碳源，不同氮源的发酵液均具有抑菌活性，以(NH4)2SO4、NH4Cl为氮源时，菌株基本未生长，发酵液抑菌效果也不强；以酵母粉为氮源时，发酵液的抑菌活性最高，此时的抑菌圈直径为17.6 mm，但活菌量并不大；以豆粕为氮源时，发酵液活菌量最高，发酵液抑菌活性也较强，此时的抑菌圈直径为16.8 mm。因此，选用能提高抑菌活性物质的酵母粉和提高菌株数量的豆粕共同作为培养基的氮源。

2.1.3 不同无机盐对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图3可知，不同无机盐对菌株GSBM05发酵液活菌量和抑菌活性影响不同。以NaCl为无机盐时，菌株GSBM05的抑菌活性最强，但活菌量没达到最高，CaCO3能有效促进菌株的生长，且抑菌活性也较强。CuSO4、ZnSO4、FeSO4等作为无机盐时，发酵液活菌量和抑菌活性均较低。因此，选用NaCl、CaCO3作为培养基的无机盐。

2.1.4 正交试验优化培养基配比 通过上述碳源和氮源单因子试验的研究，确定了液体发酵培养基最佳的碳源、氮源、无机盐等种类。为进一步优化培养基配方，采用L16(45)正交表设计5因素4水平正交试验(表1)，以发酵液的抑菌圈直径为判断标准，确定培养基中各组分的最佳配比。由表2可知，不同培养基配方组合对菌株GSBM05发酵液的抑菌活性有明显影响。其中，处理10的培养基抑菌活性最强，抑菌圈直径为22.9 mm。处理1的培养基抑菌活性最弱，抑菌圈直径仅为13.5 mm。由极差的大小可以看出，培养基配方中的5种组分对发酵液的抑菌活性影响力表现为A>C>B>D>E，由各列相应位级的抑菌圈直径平均值可以得出最佳水平组合为A3B3C4D2E3。因此，菌株GSBM05产抗菌物质的最佳培养基配方为2.0%可溶性淀粉，2.0%豆粕，3.0%酵母粉，0.3%NaCl，0.3%CaCO3。

表1 L16(45)正交优化培养基配比试验设计

表2 L16(45)正交优化培养基配比试验结果

2.2 菌株GSBM05培养条件的优化

2.2.1 装液量对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图4可知，当250 mL三角瓶中装液量为90 mL时活菌量和抑菌活性均最高，装液量过少或过多时，都不利于菌株发酵，说明菌株GSBM05生长对通气量有一定的要求。因此，最佳装液量为90 mL/250 mL三角瓶。

2.2.2 接种量对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图5可知，当接种量为2%～12%时菌株均能较好地生长，发酵液均有一定的抑菌活性，在接种量为6%时活菌量达到最大值，抑菌活性也较强。随着接种量的增加，抑菌活性逐渐降低。这可能是由于接种量过大，导致菌株生长过快，造成溶氧量不足而影响抑菌物质的生成。因此，最适接种量为6%。

2.2.3 初始pH值对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图6可知，菌株GSBM05在pH值为6.0～9.0时均可生长，其中在pH值为6.5～7.5时菌体生长量较高，在pH值为8.0～9.0时菌株生长受到一定抑制，说明碱性条件下不利于菌株GSBM05生长。在发酵液抑菌活性方面，初始pH值为6.0～8.0时发酵液的抑菌活性明显高于pH值为8.0～9.0时的抑菌活性。在pH值为7.0时，活菌量和发酵液的抑菌活性均达到最大值。因此，发酵液培养基的初始pH值以7.0为最适。

2.2.4 发酵时间对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图7可知，培养24～48 h时，活菌量逐渐增加，在48 h时达到稳定。60～120 h时随着培养时间的增加，活菌量明显下降。在发酵液抑菌活性方面，在培养24～72 h时，发酵液抑菌活性逐渐增加，并在72 h时达到最大值。在84～120 h时，发酵液抑菌活性基本保持稳定，仅有轻微的降低。综合以上结果，确定72 h为最佳发酵时间。

2.2.5 发酵温度对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图8可知，不同发酵温度对菌株GSBM05的活菌量和发酵液抑菌活性均有较大影响，在28～32 ℃时活菌量较高，在 30 ℃ 时达到最大值，随着温度的升高，活菌量逐渐下降。在抑菌活性方面，在30 ℃时发酵液表现出较强的抑菌活性。在20、40 ℃时，抑菌活性较低。温度过高或过低均不利于菌株GSBM05的生长和抑菌物质的产生，因此，选择30 ℃作为最适温度。

2.2.6 转速对菌株生长和抑菌活性物质产生的影响 由图9可知，当转速为90～150 r/min时，随着转速的增加，菌体的活菌量和发酵液抑菌活性均逐渐增加，并在150 r/min时达到最大值。当转速超过150 r/min时，菌体的活菌量和发酵液的抑菌活性逐渐下降。因此，选择150 r/min作为最佳转速。

2.3 优化培养条件与原始条件抑菌活性对比

由图10可知，原始条件下测得菌株GSBM05发酵液对葡萄白腐病病菌的抑菌圈直径为15.1mm，利用优化后的最佳培养条件(培养基配方为2.0%可溶性淀粉、2.0%豆粕、3.0%酵母粉、0.3% NaCl、0.3% CaCO3，初始pH值为7.0，装液量为 90 mL/250 mL三角瓶，接种量为6%，在150 r/min、30 ℃ 条件下振荡培养72 h)培养菌株GSBM05，测得其发酵液对葡萄白腐病病菌的抑菌圈直径达25.2 mm，与原始条件相比提高66.9%。

2.4 菌株GSBM05发酵液抑菌活性稳定性的测定

由图11可知，在温度稳定性方面，经60 ℃处理后抑菌圈直径依旧高达20 mm，随着温度的升高，菌株GSBM05发酵液抑菌活性逐渐降低，在120 ℃处理30 min后，抑菌物质失去活性；在酸碱稳定性方面，菌株GSBM05发酵液经不同pH值处理后均具有抑菌活性，在pH值为7.0、9.0时抑菌活性较高；菌株GSBM05发酵液在紫外线下照射不同时间后，抑菌活性均维持在较高水平，说明菌株GSBM05发酵液具有较好的紫外稳定性。

3 讨论与结论

芽孢杆菌在发酵中可以产生抗生素类物质如表面活性素[9]、依枯草菌素[10-11]、泛革素[12]等物质，另外，还能产生细菌素、细胞壁降解酶等拮抗蛋白类物质[13]。芽孢杆菌次生物质的产生受到培养基成分及发酵条件的影响。不同培养基成分和发酵条件可显著影响菌株生长和代谢物质的产生。卢彩鸽等的研究表明，在优化后的培养基和培养条件下，解淀粉芽孢杆菌MH71对番茄灰霉病的抑菌能力提高了37.4%[14]。洪鹏等优化后的解淀粉芽孢杆菌HF-01发酵液抑菌能力提高了37.3%[15]。

本研究通过单因素试验对GSBM05菌株产抗菌物质的最佳碳源、氮源、无机盐等进行筛选，结果表明，在不同碳源、氮源、无机盐等条件下，菌株生长量与抑菌物质活性呈正相关。可溶性淀粉作为碳源有利于菌株GSBM05生长和抗菌物质产生，而该菌株对柠檬酸和甘油的利用效果较差。氮源中，有机氮利于菌株生长和活性物质产生，在铵态氮源中菌株生长受到抑制。通过正交试验得到GSBM05菌株高产抗菌物质的最优培养基配方为2.0%可溶性淀粉，2.0%豆粕，3.0%酵母粉，0.3% NaCl，0.3% CaCO3。优化培养基中所含的5种成分均是生产上容易获得的价格相对低廉的化工原料。这为今后大量生产抑菌物质提供了先决条件。利用优化的培养基在不同条件下培养得到的最适发酵条件：pH值为7.0，装液量为90 mL/250 mL三角瓶，接种量为6%，摇床转速为 150 r/min，培养温度为30 ℃，培养时间为72 h，优化后抑菌活性提高了66.9%。在优化培养条件方面，菌株生长量与抗菌物质产量的变化并不完全一致，在测试的各因素中，培养时间对GSBM05菌株产抗菌物质影响最大。培养到48 h时，菌体含量达到最大值，但抑菌圈直径在72 h时达到最大值，随着发酵时间的延长，菌体含量明显下降，而抗菌物质却下降不明显，说明其产抗菌物质的峰值时间出现在生长衰退期。

发酵液稳定性在甲基营养型芽孢杆菌中研究较少。本试验的结果表明，GSBM05菌株在液体发酵培养中产生的抑菌物质具有较好的稳定性，紫外线照射对抑菌物质基本没有影响，当温度超过100 ℃时，抑菌活性显著降低甚至失活，发酵液在pH值为3.0～11.0处理后依然保持较高的抑菌活性。说明温度对GSBM05菌株抑菌物质活性影响较大。这与李颖等研究的枯草芽孢杆菌SH-1发酵液稳定性[16]相符。但侯宝宏等研究发现，解淀粉芽孢杆菌TS-1203产生的抗菌物质粗提物在120 ℃仍具有活性[17]。说明不同芽孢杆菌发酵液的温度稳定性不尽相同。

发酵培养基优化是微生物发酵产品向产业化转入的重要环节。本研究仅对甲基营养型芽孢杆菌GSBM05的培养基组成和培养条件进行了摇瓶发酵的初步研究，接下来还须要进一步通过发酵罐放大试验来验证发酵参数，为工业化生产提供依据。