王鹏，张吉才

(湖北医药学院附属医院·十堰市太和医院检验科，湖北 十堰 442000 )

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种复杂全身性自身免疫性疾病，病因不明[1]，在其各种临床表现中，肾脏受累是影响发病率和死亡率最重要的原因之一[2]。累及肾脏时SLE死亡率至少增加1.2倍[3]，而增生性狼疮肾炎(LN)患者10年累积肾脏存活率范围为74%～81%[4]。目前用于LN诊断的实验室标志物缺乏区分肾脏炎症和损伤的敏感性和特异性，且不易预测LN的活动性[5]。肾活检是评估LN病理严重程度和慢性病变的金标准， 由于侵入性的操作，连续活检在监测LN的治疗中较难实施。 因此，探索用于早期诊断肾脏疾病和预测SLE中肾脏炎症的新型生物标志物具有重要意义。尿液生物标志物是监测LN活动性的潜力候选生物标志物，其从肾脏排泄出来并易于获得。然而，迄今鲜有已被充分验证用于LN患者常规临床使用的生物标志物。

最近有研究关于蛋白质组学研究已经将尿血管抑制素，血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和CXC趋化因子配体4(the chemokine C-X-C motif receptor 4,CXCL4)鉴定为LN的潜在尿生物标志物[6-8]。血管抑制素是纤溶酶原的蛋白水解片段，有研究分析显示活动性SLE患者尿中血管抑制素水平升高，尤其是弥漫性增生性LN患者[6]。尿血管抑制素可将活动性SLE患者与非活动性SLE患者区分开来，并与SLE活动性和肾脏病理慢性指数显着相关。VCAM-1是参与炎症细胞和淋巴细胞运输的粘附分子。活动期SLE或LN患者血清和尿VCAM-1升高[9]。有研究[10]显示， SLE患者尿VCAM-1水平升高，并与肾活动性和SLEDAI评分相关。CXCL4也称为血小板因子4(PF4)，是一种有效的抗血管生成趋化因子[11]。鉴于LN患者中这三种尿蛋白标志物的数据，本研究拟展开研究，以评估这些标志物在预测SLE活动性肾脏疾病方面的表现，与传统的SLE标志物进行比较。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象及分组

根据2015年美国风湿病学会(ACR)分类标准诊断，于2016年5月至2017年5月从本院门诊或住院患者中招募SLE的成年患者(n=227;80例非活动性SLE患者，67例活动性非肾型SLE患者，80例活动性肾型SLE患者;女性94%;年龄(39.2±13.8)岁和53例正常对照组(女性96%，需排除肝、肾损害)。采集血液(抗dsDNA，补体C3 / 4水平)及临床表现用于评估SLE活性，收集尿样用于血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的测定。所有活动性SLE的患者的血液和尿液样品均在接受免疫抑制治疗之前收集。同时招募一组健康受试者作为对照。所有受试者均签署知情同意书，本研究经医院行政伦理委员会批准。

通过SLE疾病活动动指数(SLEDAI)评估SLE疾病活性，并将LN患者分为3组：非活动性SLE患者组(SLEDAI=0的患者和在其他系统中没有被SLEDAI评估活动性的患者)、活动性非肾病SLE患者组(SLEDAI≥1和/或其他系统没有活动性的患者，但不包括“活动性肾脏SLE”)、活动性肾病SLE患者组(肾脏SLEDAI≥5的患者)，同时设置健康人群对照组。在招募时收集的资料包括人口统计学资料和临床特征，肾功能参数(LN的组织学类别，尿蛋白与肌酸酐比率和沉积物以及活动性肾病患者中的血清肌酐)的临床数据， 评估SLE疾病活动性和器官损伤。 在这些患者组和对照组中比较尿蛋白标记物水平和检测尿标记物与各种肾脏参数之间的相关性。

1.2 血清和尿蛋白标记物的测定

抗dsDNA的血清效价(欧蒙公司)，尿液中的血管抑制素、CXCL4和VCAM1的水平(R&D公司)均采用ELISA法检测，免疫比浊法(雅培)测定血清补体水平，所有测量均重复测定，用尿肌酐对这些尿蛋白标志物的值进行标准化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象

共有227例SLE患者(女性94%)参与了研究。平均年龄(39.2±13.8)岁，平均SLE病程(7.3±7.0)年。80例(35%)肾活检，67例(30%)活动性非肾病SLE，80例(35%)非活动性SLE。53名健康受试者女性96%;平均年龄(25.8±3.9)岁作为对照组。表1显示了研究中SLE患者的临床特征。非活动性SLE患者比其他患者年龄大，病程长。 活动性肾病SLE患者更可能具有抗La抗体，但是抗磷脂抗体阳性较少。活性性肾病SLE患者的总SLEDAI显着高于活动性非肾病SLE患者。霉酚酸酯和他克莫司在活动性肾病SLE患者中应用较多，而羟基氯喹更常用于活动性非肾病SLE患者。然而，系统性狼疮国际诊断联盟(SLICC)器官损伤评分在3组SLE患者中相似。

2.2 血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的尿液水平

检测4组研究对象中血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的尿液水平，其中活动性肾病SLE患者的三种蛋白质水平均显著高于活动性非肾病SLE患者或非活动性SLE患者和健康对照者(表2)。在非活动性SLE患者(n=80)中，有肾脏疾病史的患者(n=39)略高于没有肾脏疾病史的患者(n=41)，血管抑制素水平分别为[(0.38±0.65)ng/ngvs. (0.31±0.48 )ng/ng，P=0.49]；CXCR4[(0.46±1.97)pg/ngvs. (0.31±1.01) pg/ng，P=0.59]；VCAM-1[(169±380)pg/ngvs. (150±337) pg/ng，P=0.63)]。 但差异没有统计学意义。

表1 本研究中SLE患者的临床特征

aPL抗磷脂，a抗心磷脂IgG或狼疮抗凝血剂。

表2 研究对象中的尿蛋白标记物

a.活动性肾病与活动性非肾病SLE组的P值;b.活动性SLE与非活动性SLE组的P值。

2.3 通过ROC曲线分析

表3显示了AUCs和最佳cut-off值。在三种尿蛋白标记物中，血管抑制素在鉴别活动性肾病与活动性非肾病SLE中显示出最高的AUC和特异性/敏感性。另一方面，在活动性肾型和活动性非肾性SLE患者中，CXCL4和VCAM-1与常规血清学标志物(抗dsDNA和补体C3)具有相似的AUC和特异性/敏感性。在活动性SLE和非活动性SLE患者中，所有三种尿蛋白标记物与常规标记物(抗dsDNA和补体C3)相比，具有相似的AUC和特异性/灵敏度指标。

2.4 三种尿蛋白标志物对活动性与非活动性LN的诊断性能

表4显示了三种尿蛋白标志物与血清抗dsDNA和低补体C3水平相比，在区分活动性肾型和活动性非肾型SLE,以及活动性SLE和非活动性SLE的表现。同样，尿液血管抑素与CXCL4或VCAM-1相比，在鉴别活动性肾型和活动性非肾型SLE方面显示出更高的特异性，敏感性，阳性和阴性预测值。后两个标记物在区分3组SLE患者的中表现与抗dsDNA或补体C3相似。

表3 ROC分析蛋白质标记的cut-off值

表4 蛋白质标志物在的SLE患者不同区组中的表现

3 讨论

本研究发现活动性肾病SLE患者尿液中的血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的水平显著高于活动性非肾病或非活动性SLE患者。这些尿液标志物的水平与SLE疾病活动性评分，肾病活动性评分和尿蛋白水平显著相关。这些标记物能够区分活动性肾脏和活动性非肾脏性SLE，以及活动性SLE和非活动性SLE。经活检证实为活动性LN的患者中，尿CXCL4和VCAM-1与活检活动性指数相关，但与蛋白尿无关。另一方面，尿血管抑素与蛋白尿相关，但不与活检活性指数相关。这些观察结果表明导致蛋白尿的致病机制和导致肾脏病理学“活动性”的组织学变化可能不相同。足状突细胞失能可能导致蛋白尿，但不是活性指数的变化。进一步的研究有助于研究血管抑制素如何与机体蛋白尿相关，并深入了解CXCL4和VCAM-1对肾脏病理学“活动性”的特定方面的影响。

血管抑素是纤溶酶原的N-末端片段，是一种有效的血管生成抑制剂，其能特异性抑制增殖并诱导血管内皮细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长[12]。最近，血管抑制素已经显示出通过抑制嗜中性粒细胞的活化和迁移而具有抗炎特性[13]。在慢性肾损伤的小鼠模型中，使用表达血管生成抑制素的重组腺病毒治疗显示可以延缓肾脏疾病的进展，这可能与其抗炎作用相关。血管抑制素与肾SLEDAI和组织学慢性指数显着相关。本研究结果证实了尿血管抑制素是一种能够区分活动性肾病和活动性非肾病SLE的标志物，具有比抗dsDNA和C3补体更高的特异性/敏感性。尽管尿血管抑制素与蛋白尿程度相关，但是我们无法证实血管生成抑制素在亚组分析中与肾组织学严重性或活动性相关，可能与具有不同组织学类型LN的患者样本有限以及相当比例的患者具有混合的LN的组织学类型。

VCAM-1是免疫球蛋白家族的一员，是一种通过与位于白细胞上的整合素相互作用参与炎症细胞聚集的粘附分子。在包括SLE和类风湿性关节炎的几种自身免疫疾病中，可溶性VCAM-1水平升高[9,14]。这与本研究结果一致，证实了活动性LN患者尿VCAM-1水平升高，并区分活动性肾病与活动性非肾病SLE患者。

CXCL4是一种有效的抗血管生成趋化因子，通过整联蛋白依赖性机制影响血管生成。循环CXCL4水平在系统性硬化症患者中增加并且与心脏和肺疾病的进程相关[15]。然而，CXCL4在免疫介导的肾小球肾炎患者尿液中排泄的起源和机制仍不清楚。在目前的研究中，患有活动性SLE和LN的患者的尿CXCL4升高。尽管CXCL4对活动性肾脏疾病的识别能力并不显著优于血管抑制素，但与肾活检组织活性评分显著相关。应进一步在长期纵向研究中评估CXCL4 作为LN发作和预后(肾纤维化)的潜在生物标志物。

综上所述，本研究发现新型尿生物标志物血管抑制素，CXCL4和VCAM-1可区分患者的活动性肾脏和非肾脏SLE疾病。这些生物标志物的尿液水平与SLEDAI，肾SLEDAI和尿蛋白水平显著相关。这些数据表明评估这三种尿蛋白标记物在LN的活动性和预后评估中有重要临床价值。