吴宇佳，吉清妹，解 钰，雷 菲，郑道君

（海南省耕地保育重点实验室·农业部海南耕地保育科学观测实验站·海南省农业科学院农业环境与土壤研究所 海口 571100）

连作障碍是指在同一块土壤中连续种植同一种作物或者是近缘作物时，即使在正常的栽培管理条件下，也会出现生长变弱、产量降低、品质下降甚至死秧的现象[1]。近年来，西瓜种植面积普遍较大，且呈现大规模的专业化发展趋势，由于耕地面积匮乏，西瓜连作已不可避免。然而，连作障碍问题严重制约着西瓜产业的健康发展。西瓜嫁接技术目前已经大面积推广，主要解决了西瓜连作障碍问题，但也增加了育苗成本，同时由于西瓜嫁接苗在其些品质或性状上受砧木的影响从而对西瓜的品质和生长发育造成影响。所以，解决西瓜连作障碍应从连作本身进行研究。由于连作形成了特殊的土壤环境，土壤有益微生物减少、有害微生物增加，导致土传病害加重[2-3]，根际微生物种群失衡，多样性水平降低，病原拮抗菌减少[4-8]，病虫危害加重，土壤养分利用率降低。

近年来发现的ERIC序列是存在于原核生物基因组中的一类短的重复序列。该序列在染色体上的分布和拷贝数具有种间特异性，根据序列中心高度保守的44 bp的ERIC核心序列设计反向引物，可扩增出反映细菌基因组结构特征的谱带。由于ERIC-PCR快速简便，图谱重复性好，适用于细菌分类鉴定、环境监测、污染治理以及人和动物肠道菌群结构研究等方面[9]。

笔者采用ERCI-PCR技术，研究连作西瓜在不同茬数和不同生育期土壤细菌的多样性指数、丰富度指数和均匀度指数之间的差异，并探讨土壤细菌群落指数在同一茬数4个不同时期的变化趋势，旨在阐述连作茬数及不同生育期对土壤细菌群落结构及组成分布的影响，同时也为今后选择适宜的时期，人为引入有益的土壤微生物等措施调整土壤微生态环境，发挥有益微生物的作用，抑制病原菌发展，提高西瓜抗病能力与品质，为实现农业的可持续发展提供重要科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤与西瓜品种

试验地点为海南省农科院农业环境与土壤研究所大棚，供试土壤是未种过瓜类的大棚菜田土，理化性质为：碱解氮含量（w，下同）135.8 mg·kg-1、速效磷含量 169.15 mg·kg-1、速效钾 91.11 mg·kg-1、有机质1.39%、pH 5.98。供试西瓜品种为‘红冠龙’。

1.2 试验设计

西瓜种植模式为单行单垄，垄长15 m，宽1.3 m，覆盖黑色地膜。试验设3个重复，每垄为1个重复，对照不种作物，面积3 m×3 m。西瓜采用种子直播，连种3茬。

1.3 土壤取样

取样前，控制土壤湿度，在湿度相对一致时采样。在不同生长期分别采取根际、非根际土样和对照土样于50 mL离心管中，-20℃条件下冷冻保存（表1）。

表1 供试土壤取样情况

西瓜种植第3茬时，于成熟期发枯萎病死株，无法取样。最终取得对照、根际、非根际共33个土壤样品。

1.4 土壤微生物总DNA提取与PCR扩增

土壤微生物总DNA提取方法采用改良CTAB法[10]，以提取的土壤总DNA为模板进行ERCI-PCR扩增反应。ERCI引物序列按Versalovic J等(1991)报道的进行设计，即为 ERIC1R：5'-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-3'；ERIC2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'；20 μL反应体系：10×PCR buffer 2.0 μL，Mg2+浓度为 2.0 mmol·L-1，dNTPs 浓度为 200 μmol·L-1，2.0 UTaqDNA 聚合酶，30 ng 模板 DNA，正反引物浓度为 0.4 μmol·L-1，剩余体积用ddH2O补足至20 μL。按下述程序进行扩增：预变性 94℃ 4 min；变性 94℃ 30 s，退火47℃ 50 s，延伸 72℃ 120 s，35循环，最后 72℃延伸10 min。反应重复1次。

8.0 %聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，对照分子量标准：50 bp与 100 bp DNA Ladder，缓冲液 0.5×TBE，电压 80～100 V，相机拍照并记录结果。

1.5 数据处理与分析

1.5.1 ERCI-PCR数据分析 用Shannon-Weaver指数和其均匀度指数来表示群落DNA序列多样性，通过ERIC-PCR电泳图，按吴宇佳等[10]的 RAPD-PCR产物分析方法，计算 33个土样细菌的ERIC-PCR产物、Shannon-Weaver指数及其均匀度指数，分析待测土样的细菌多样性变化。

Shaanon-Weaver指数及其均匀度指数计算：

Dsh=-∑PilnPi=-∑(Ni/N)ln(Ni/N)，

Jsh=Dsh/lnS。

式中，Dsh表示Shannon-Weaver指数，Jsh表示均匀度指数，Pi表示第i个RAPD条带出现的概率，Ni表示第i个RAPD条带的扩增量，N表示土壤微生物群落DNA的RAPD条带的扩增总量（N=∑Ni），S则表示群落DNA序列的丰富度指数。Dsh最小值0，最大值lnS。

采用DPS 6.0计算得Shannon-Weaver指数及均匀度指数。

1.5.2 土壤细菌指标分析 不同茬数不同生长时期土壤细菌多样性指标间的差异比较、环境温度与土壤细菌多样性指标的相关性分析均用JPM 6.0统计。

2 结果与分析

2.1 不同茬数、同一茬数不同生长时期的非根际土壤细菌多样性变化

由图版A（见彩色插页第10页）与表2可知，不同生长期非根际土壤微生物细菌多样性的差异显著，丰富度从 7～16，变异系数为 26.35%，Dsh在2.662 0～3.991 5之间，变异系数为12.30%；但不同生长期非根际土壤细菌的均匀度变化不大，变异系数仅为1.90%。其中，第1茬收获期非根际土壤细菌生物多样性最高，丰富度和Dsh分别为16和3.991 5；第1茬初果期最低，丰富度和Dsh分别为7和2.662 0，均匀度在此期也达到最小值。在3个茬口中，第1个茬口的平均Dsh为3.20，第 2个茬口的平均Dsh为14.27，第3个茬口的非根际土壤细菌多样性随之下降，平均Dsh为3.57。

为了验证取样温度对非根际土壤细菌多样性的影响，对取样温度与Dsh、Jsh和丰富度进行了相关性分析。结果表明，取样温度与Dsh、Jsh呈负相关，相关系数为：-0.587 6和-0.300 3，但负相关性不显著，即p＞0.05；取样温度与丰富度呈负相关，相关系数为-0.604 1，且p＜0.05，负相关性显著。可见，取样温度对非根际土壤细菌多样性有较大的影响。

2.2 不同茬数、同一茬数不同生长期的根际细菌多样性变化

由图版B（见彩色插页第10页）、表2可知，西瓜连作后，西瓜根际土壤细菌多样性发生了显著变化，种群丰富度在7～16之间，变异系数达到30.31%；Dsh在2.678 6～3.960 0之间，变异系数为12.92%，但种群的均匀度变化不大。其中，第1茬伸蔓期和初果期的Dsh均较小，分别为2.678 6和2.680 3，均匀度在这2个时期也达到最小值。第1茬收获期的根际细菌多样性最为丰富，Dsh=3.960 0。

表2 西瓜连作对土壤细菌多样性指数的影响

进一步的分析结果表明，取样温度与丰富度、Dsh、Jsh 呈负相关，相关系数分别为：-0.644 3、-0.389 1和-0.613 2，其中，负相关显著的是Dsh和丰富度，p＜0.05。即取样温度对根际土壤细菌多样性有较大的影响。

2.3 连作对同一茬数同一时期不同土样影响的比较

对比分析结果表明，虽然取样温度对土壤细菌多样性变化有较大影响，但从整体上看，所有样品的根际土壤细菌Dsh（12.92%）和丰富度（30.31%）的变异系数均比对照土壤的高，非根际土壤的次之。此外，从表2和图版C（见彩色插页第10页）中也可以看出，无论取样温度变化多大，每一生长时期的样品中，根际土壤细菌多样性均是最小的。可见，西瓜连作后，对细菌多样性和群落结构影响大。

进一步分析表明，连作西瓜根际土壤在不同茬口不同生长时期的细菌多样性差异较大，其中第2茬伸蔓期和第3茬初果期根际土壤细菌的Dsh影响最大，变异系数分别达到10.7%和10.91%。第1茬伸蔓期（7.48%）到初果期（8.16），第 3茬幼苗期（7.00%）到伸蔓期（6.06%）对根际土壤细菌的多样性影响也较大。但在第1茬初果期和收获期对根际土壤细菌多样性的影响基本没有，CV仅分别为1.16%和1.71%，这可能是由于低温所致，这2个时期取样温度分别为18.5℃和16.5℃。

3 讨论

3.1 应用分子标记技术分析土壤微生物多样性

分子标记技术被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能及动态监测等方面。这些方法主要有：DGGE（变性梯度胶电泳技术）、TGGE（温度梯度凝胶电泳）、ARDRA（16S rDNA的限制性片段长度多态性分析）、T-RFLPs（16S rDNA末端标记限制性片段长度多态性分析）、SSCP（单链构象多态性）、和ERIC-PCR（肠杆菌基因间的重复共有序列扩增图谱分析）等方法。通过这些分子生态学技术，土壤管理者可根据实际情况，快速、准确、全面且有针对性地调理土壤微生物数目与种类，制定农业生产措施与耕作制度。

ERIC-PCR用于研究生态系统中微生物群落的结构，其PCR产物经电泳分离成微生物群落特有的条带。条带的数量、位置及亮度能反映出微生物群落结构的特征。ERIC-PCR技术重复性好、灵敏度高，可高效地动态监测生态系统中微生物群落结构的变化[11]。1999年，科学家首次在混合菌群群落结构的分析上应用ERIC-PCR技术，得到的指纹图谱能反映菌群组成差异且重复性、稳定性好。之后，ERIC-PCR逐渐用于微生物群落的结构分析。在本研究中，ERIC分析亦较好地揭示了西瓜连作对根际土壤细菌多样性的影响。应用ERIC-PCR技术研究土壤微生物群落结构具有操作简单、硬件要求低等特点，具有较好的应用前景。

3.2 连作作物的土壤细菌多样性

土壤微生物对植物土传病害的抑制作用是在土壤微生物群体影响下完成的，并不是单一菌群作用的结果[12-13]。土壤中细菌数量是衡量土壤中微生物区系状况的一个重要指标之一。相关研究表明，连作后土壤中细菌数量会下降，导致土壤类型由细菌型向真菌型转变[14-16]。而另外一些研究显示，部分作物连作后土壤细菌数量上升[17-18]。赵萌等[19]分析了西瓜连作对土壤主要微生物类群的影响，结果显示，随着连作茬数的增加，土壤细菌数量和放线菌数量先升后降，真菌数量则相反。因此，开展连作作物土壤多样性研究非常重要。在本研究中，虽然取样温度对土壤细菌多样性变化有影响，但从整体上看，不管哪个时期，同一生长时期的根际土壤细菌多样性均比非根际土壤和对照土样的低。西瓜连作对不同茬口不同生长期根际土壤细菌多样性的影响差异较大，ERIC分析结果表明，第2茬伸蔓期和第3茬初果期根际土壤细菌的Dsh影响最大，变异系数分别达到10.7%和10.91%。第1茬伸蔓期（7.48%）到初果期（8.16%）、第 3茬幼苗期（7.00%）到伸蔓期（6.06%）对根际土壤的细菌多样性影响也较大。对于连作西瓜土壤微生物中各类细菌数量的具体分析仍需深入探讨。

4 结论

（1）ERIC-PCR技术可用于连作西瓜土壤微生物多样性方面的研究。（2）不同生长期，连作西瓜的根际与非根际土壤细菌多样性均有较大变化，Shannon-Weaver指数和丰富度指数的变异系数均在12%以上。（3）取样温度与连作西瓜根际、非根际细菌Shannon-Weaver指数、均匀度指数和丰富度指数呈负相关，其中与丰富度指数呈显著负相关，相关系数达0.60以上。（4）根际细菌多样性影响在不同生长期是不一样的，第3茬初果期影响最大，第2茬伸蔓期次之。第3茬初果期和第2茬伸蔓期根际土壤细菌的Dsh影响最大，变异系数分别达到10.91%和10.7%。