热比姑丽·伊斯拉木 美热古丽·热合曼 艾西木江·热甫开提 买合苏提·卡德尔 阿不都吉力力·阿布都艾尼

(1 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐，830049； 2 新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐，830049； 3 新疆维吾尔自治区维吾尔医医院皮肤治疗中心，乌鲁木齐，830049)

银屑病(Psoriasis)别名牛皮癣，是由多基因和多因素共同作用而引起的一种复杂的、特征性鳞屑性丘疹的慢性炎性皮肤病。近期临床调研发现，本病发病率较高，病程也较长，而且容易复发，主要侵犯青壮年。本病不仅影响患者身体健康，更重要是对患者精神影响较大。所以，银屑病是一种皮肤病领域重点探索的疾病。长期的临床实践已验证，我区各家维吾尔医医院治疗银屑病方面有自己的特色和优势，积累了丰厚的实践经验及成果，并形成了成熟异常体液和清除异常体液、活血化瘀和消除炎性反应、止痒和抑制鳞屑为基本原则，及时采取调理疗法、内服外用药物疗法及非药物疗法、饮食疗法和精神疗法等一整套较成熟的综合疗法和技术。通过临床实践证明其综合疗法和技术疗效确切，无明显不良反应[1-4]。我们分别采集我区维吾尔医医院维吾尔医综合治疗的银屑病患者和通过体检确定健康志愿者血清，利用1H-NMR技术分析检测健康志愿者、银屑病患者血清差异性代谢组分，以提高我区维吾尔医医院银屑病的疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年4月至2015年10月新疆维吾尔自治区维吾尔医医院皮肤科住院银屑病患者30例，均符合银屑病诊断标准、纳入及排除标准[5-6]。选取新疆维吾尔自治区维吾尔医医院通过体检确定的30名健康志愿者。均通过新疆维吾尔自治区维吾尔医医院伦理委员会批准(2014-009)，以及健康志愿者和银屑病患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器 1)重水(Deuteriumoxide，D2O)(美国Cambridge Isotop Laboratories,Inc)；2)5 mm核磁管(德国Bruker公司)；3)Inova 600兆超导核磁共振波谱仪(美国Varian公司)；4)核磁共振波谱仪工作站(美国Varian公司)；5)-80 ℃超低温冰箱(中国海尔公司)；6)5424低温高速离心机(德国Eppendorf股份公司)。

1.2.2 样品收集及处理 收集银屑病患者和健康志愿者早餐前空腹肘部静脉血液，并分离血清，保存在-80 ℃低温冰箱中待测。样品从冰箱取出，在室温解冻，取200 μL血清加400 μL磷酸盐生理盐水缓冲液(每100 mL生理盐水0.045 mol K2HPO4和NaH2PO4，其溶液分别为80%的H2O和20% D2O，pH=7.4)混匀，室温下静置10 min；随后，以10 000 r/min速度，半径为5 cm，离心10 min。取550 μL上清液，加到5 mm核磁管内。

1.2.3 核磁共振氢谱的测试 将上述已备好的核磁管放入仪器进行1H-NMR谱检测。本实验1H-NMR图谱测定均在Inova 600核磁共振波谱仪上用ID探头采用弛豫编(Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG)脉冲序(RD-90°-τ-180°-2τ-180°-2τ-180°-…-ACQ)，25 ℃检测温度，599.15 MHz氢谱核磁共振频率。对于样品而言，共有32 768个采样数据点，128次累加扫描次数，谱宽均为20 ppm，采样时间均延迟2 s，1.64 s均作为采样时间(AQ)，对所有样品采用预饱和方法压制水峰处理。为有利于解谱工作顺利进行，选取质量较高的1H-NMR谱样品进行二维核磁共振图谱的测试，包括1H-1H同核相关谱(1H-1H Homonuclear Correlation Spectroscopy，1H-1H COSY)，质子全相关谱(Total Correlation Spectroscopy，TOCSY)和J-分解谱(J-Resolved Spectroscopic，J-RES)等用于谱图中各种峰的指认，以便于代谢成分的鉴定。

1.3 统计学方法 基于原始1H-NMR图谱数据量庞大、数据点的高度相关性以及溶剂峰等因素影响而不能直接用于模式识别分析，还需要对1H-NMR图谱数据进行预处理。本实验血样1H-NMR图谱数据采用0.3 Hz线宽的指数窗函数，首先进行傅立叶变换，随后进行基线和相位调整。在血样图谱，以δ5.233pp质子信号的ɑ-葡萄糖可作为参考定标，在δ9.0～0.5范围内，对每δ0.003积分段进行自动积分。同时，把积分值以文本格式保存，并导入Microsoft Excel内。其中排除δ5.22～4.66范围内的1H-NMR谱水信号，其余积分值归一化处理(每段积分值除总积分值)。采用SIMCA-P+11.0(Umetrics Inc.，Umea，瑞典)软件包进行正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA)，通过所有代谢物及相关系数，确定健康志愿者与银屑病患者差异性代谢组分，检验水准ɑ=0.05，R2Y和Q2所建立的模型的质量评价指标。本实验通过Pearson相关系数显著性检验的r与R临界值，确定P<0.05为差异有统计学意义的代谢产物临界值。

2 结果

2.1 健康志愿者、银屑病患者OPLS-DA模式分析 我们同样地进一步利用OPLS-DA建立模型的方法采用评估银屑病患者与健康志愿者之间的代谢物差异，结果分别见图1，2。结果显示对健康志愿者与银屑病患者之间有一定分离的趋势，银屑病患者区分程度和预测程度都可以达到要求(健康志愿者与银屑病患者，模型预测参数分别为R2X=0.26，R2Y=0.73，Q2=0.53)。

图1 健康志愿者及银屑病患者血清OPLS-DA得分图

注:▲为健康志愿者，■为银屑病患者

图2 健康志愿者及银屑病患者血清OPLS-DA空间分布图

注:▲为健康志愿者，■为银屑病患者。模型预测参数分别为R2X=0.26，R2Y=0.73，Q2=0.53

表1 健康志愿者、银屑病患者血清主要差异性代谢物及其相关系数

注:s,单峰;d,双重峰;t,三重峰;q,四重峰;m,多重峰;dd,双重双重峰

2.2 健康志愿者、银屑病患者标志物的发现与鉴定 本实验通过数据分析，在健康志愿者与银屑病患者血样品共发现12种差异性代谢物。与对照组比较，银屑病患者血清极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、不饱和脂类、糖蛋白、酪氨酸、组氨酸及丙酮含量降低，与健康志愿者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，与健康志愿者比较，银屑病患者血清乳酸、肌酸、甲酸、乙酸及苯丙氨酸含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3 讨论

皮肤是人体最大、同样也是重要的器官，使紧密地联系机体内外，并能敏锐地反映内外变化情况。人体是一个整体，许多全身性疾病都可引起不同皮肤症状，同样皮肤也可反映,甚至提示体内存在的各种病理变化。随着人们对银屑病病因、发病机制的深入研究，逐步认识到银屑病不但是一种单纯性皮肤病变，反而是以皮肤为主要表现的全身性、炎性反应疾病。众多研究发现，银屑病容易伴发或并发代谢性疾病，如心血管系统疾病[7-8]、胰岛素抵抗/糖尿病[9-10]、血脂代谢紊乱[11-12]、肥胖及代谢综合征[13-14]。银屑病患者代谢性疾病发生比例高于一般人群，因此，银屑病是慢性炎性反应皮肤病，而且也是系统性疾病，可伴发或并发代谢性疾病。银屑病和代谢综合征间可能存在遗传、环境和免疫等方面关联性。

Asha等[11]，Salihbegovic等[12]报道，银屑病患者可能存在脂蛋白代谢紊乱、血脂水平升高、表皮中脂质代谢不正常等，甚至阐明银屑病患者易伴发高脂血症、动脉粥样硬化等疾病。提示，银屑病患者体内存在脂代谢紊乱，且其紊乱严重情况可能与疾病类型有关。本试验结果显示，银屑病患者血清极低密度脂蛋白(VLDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平降低，与健康志愿者血清水平差异有统计学意义(P<0.05)，这与上述报道相似[11-12]。不饱和脂类水平降低，这与银屑病患者急性发病期收治入院相符，其中作为能量储备的脂类偏低可能与机体短期能量消耗大有关[15]。

王晓华等[16]，刘英等[17-18]检测银屑病患者血浆氨基酸差异性代谢组分，结果表明，银屑病患者芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、天门冬氨酸及赖氨酸升高，而苏氨酸、甘氨酸降低，与健康志愿者水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示，银屑病患者可能存在蛋白质或氨基酸代谢紊乱。本试验结果表明，银屑病患者血清酪氨酸和组氨酸(生糖氨基酸)水平降低，肌酸和苯丙氨酸(必需氨基酸)水平升高，与健康志愿者血清水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，这与上述报道相似[16-18]。机体内在特殊情况下，苯丙氨酸和酪氨酸可以相互转化，故本实验中2个芳香族氨基酸可能出现相对高低。银屑病患者血清糖蛋白水平降低，与健康志愿者血清水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，这可能与银屑病患者机体免疫功能低下有关。由于糖蛋白是蛋白质的糖基化产物，参与机体的天然免疫反应或获得性免疫反应，在机体内疾病发生方面起着重要作用[19]。

本试验结果显示，银屑病患者丙酮水平降低，乳酸水平升高，与健康志愿者血清水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其原因是丙酮是脂类，尤其是脂肪酸在肝细胞内氧化分解时产生的中间产物。丙酮一般易挥发，部分经过肺脏、肾脏排除；其余部分丙酮进入三羧酸循环，在一系列催化剂(酶)的作用下转化为乳酸或丙酮酸，促进糖异生。银屑病患者乙酸水平升高，与健康志愿者血清水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，这可能与乙酸代谢异常是肝功能损伤的标志，而银屑病患者伴有肝功能的损害，与相关报道相似[18]。

总之，经过我区维吾尔医医院维吾尔医综合治疗的银屑病患者血清氨基酸、脂类及其一些小分子化合仍出现代谢紊乱，这可能与银屑病是一种常见的“慢性、复发性、炎性反应性”疾病有关。通过血清代谢组学检测实验结果得知，临床医护人员应该把人体作为一个整体来考虑，不但单独治疗银屑病，而且也治疗一些代谢紊乱所致的并发症或并发症、保护肝肾功能，有助于提高疗效。同时，我们有必要分别对脂代谢紊乱、氨基酸代谢紊乱与银屑病疾病类型之间的关系有待于深入研究。