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(1.天津市植物保护研究所， 天津 300381； 2.天津科润蔬菜研究所， 天津 300384)

普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)，别名芸豆、四季豆等，起源于中南美洲，我国为次级起源中心[1]。普通菜豆在我国有悠久的栽培历史，我国是世界上重要的菜豆资源和生产国之一，各省均有栽培，主产区分布在黑龙江、山西、内蒙古、陕西、贵州、云南等省区[2]。但病害已成为菜豆生产中的主要限制因素。目前已报道的菜豆上真菌性病原有22属36种，炭疽病、角斑病、锈病、根腐病和枯萎病是生产中的重要真菌病害，对我国菜豆的产量和品种造成巨大的影响[3]。

种子可以携带大量危害种苗或植株的病原，在病害传播过程中担当重要传播媒介[4]。种子真菌可以吸附于种子表面或侵入种子组织内部，引起病害从一个生长季传播到下一个生长季，从一个地方扩展到另一个地方，从而对种子萌发、幼苗生长、成株健康方面造成巨大的负面影响[5]。种子健康检测的目的是测定种子样品的健康状况，据此推测种子批是否携带有害病虫，为种子质量提供有关信息。种子携带病原真菌及其携带量的检测是种子健康检验的重要组成部分[6]。

目前，我国对于菜豆种子携带真菌的研究几乎属于空白，仅见程美仁[7]1988年对北京地区4个主要菜豆品种的种子携带病原真菌进行初步检测。因此，本项目鉴于近年来菜豆种植中真菌病害，尤其是菜豆根腐病在我国的发生逐年加重，以京津冀地区4个主栽培品种为代表，开展菜豆种子携带真菌病原的检测研究，并测定不同杀菌剂对种子携带致病镰刀菌的药剂敏感性，明确菜豆种子携带病原真菌的情况，筛选种子处理药剂，为种子生产、调运过程中种传病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菜豆品种4个，白花架豆(中国农业科学院蔬菜花卉所)，白玉满架(天津蓟县四季种子有限公司)，83-B架豆(北京绿百旺农业技术研究所)，双丰1号(天津市农业科学院蔬菜研究所)，以上种子均在通风干燥的条件下保存备用。

供试杀菌剂4个，分别为70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)、10%苯醚甲环唑水分散粒剂(瑞士先正达作物保护有限公司)、250 g/L吡唑醚菌酯乳油(巴斯夫中国有限公司)和25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂(先正达南通作物保护有限公司)。

表1 菜豆种子外部携带真菌种类及分离频率

品种分离频率/带菌频率(%)镰刀菌属(Fusarium)链格孢属(Alternaria)木霉属(Trichoderma)曲霉属(Aspergillus)青霉属(Penicillium)毛壳菌属(Chaetomium)白花架豆23.53/2.0014.71/1.6720.59/1.3320.59/2.338.82/1.0011.76/1.33白玉满架6.06/0.6727.27/2.3318.18/2.00—/—15.15/1.3333.33/3.0083-B架豆23.08/2.0030.77/2.33—/—30.77/2.00—/—15.38/1.33双丰1号11.11/1.0033.33/3.00—/—18.52/1.333.70/0.3333.33/2.67

注：“-”为未检出到该菌。下同。

表2 菜豆种子内部携带真菌种类和分离频率

品种分离频率/带菌频率(%)镰刀菌属(Fusarium)链格孢属(Alternaria)曲霉属(Aspergillus)青霉属(Penicillium)白花架豆3.33/25.00—/—6.67/503.33/25.00白玉满架5.00/37.55.00/37.53.33/25—/—83-B架豆—/—1.6710.0010.00/605.00/30/00双丰1号3.33/28.57—/—6.67/57.141.67/14.29

1.2 种子带菌检测

采用吸水纸法[7-8]，将无菌滤纸置于培养皿底部，加入0.5 mL水溶性0.2% 2,4-D钠盐溶液浸润滤纸保湿。供试4个品种中，随机挑选300粒种子进行检测。种子外部带菌直接培养镜检。种子内部带菌将种子外部消毒处理后，置于培养皿保湿培养。种子内部和外部带菌检测每皿50粒种子放入25 ℃恒温培养箱中培养7 d，当种子周围长出菌丝或表面有霉层时，移入PDA 培养基上进行纯化培养，根据培养性状和显微形态特征进行分类鉴定。计算种子的带菌率和分离频率。

种子带菌率(%)=(带菌种子数/检测种子总数)×100%；

特定菌分离频率(%)=(带某类菌种子数/带菌种子总数)×100%。

将分离的真菌纯化后保存。

1.3 种子携带镰刀菌致病力的鉴定

将种子外部和种子内部分离到的镰刀菌分离物纯化，对其进行致病力鉴定。具体方法如下：将分离到的镰刀菌在PDA培养基上纯化培养7 d后，用灭菌的刷子刷下孢子，配成浓度为106个孢子/mL的镰刀菌孢子悬浮液。以白花架豆为供试品种，进行催芽，播种。待豆苗长出2片子叶时期灌根接种镰刀菌孢子悬浮液，每个菌株接种10株豆苗，空白对照不接菌，接种后待出现发病植株开始调查发病情况。按柯赫氏法则对病原菌再分离鉴定。

1.4 不同杀菌剂对菜豆致病镰刀菌室内毒力测定

采用菌丝生长速率法。在药剂浓度为1 000，500，200，100，50，10，1，0.1 mg/L的PDA平板上测定4种常用种衣药剂对致病镰刀菌菌丝生长的抑制作用。将直径为4 mm镰刀菌菌块，菌面向下接种在不同浓度药剂平板的中心，放入25 ℃，恒温培养5 d。每处理3次重复，以加无菌水为对照。采用十字交叉法测量菌丝扩展直径，于空白对照菌落直径相比，计算不同药剂对镰刀菌的抑制率，回归方程和有效中浓度(EC50)。

2 结果与分析

2.1 菜豆种子表皮携带真菌检测

通过吸水纸检测的方法发现，从不同菜豆种子分离到6个属的真菌，其中2个属的菌株可能为菜豆病原真菌，分别为引起菜豆根腐病的镰刀菌(Fusariumspp.)和菜豆黑斑病的链格孢(Alternariaspp.)。另外，菜豆种子表皮还携带包括曲霉属(Aspergillusspp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、木霉属(Trichodermaspp.)和毛壳菌属(Chaetomiumspp.)类腐生菌。不同菜豆品种表皮携带真菌具有一定的差异(表1)，白花架豆和83-B架豆上携带的镰刀菌分离频率较高，分别为23.53%和23.08%。白花架豆、白玉满架和83-B架豆上携带的链格孢菌较多，分离频率在30%左右。腐生菌中曲霉菌属和毛壳菌属分离频率显著高于木霉属和青霉属。

2.2 菜豆种子内部携带真菌检测

从试验菜豆种子的内部分离到4类真菌，分别为镰刀菌(Fusariumspp.)、链格孢(Alternariaspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)和青霉(Penicilliumspp.)。分离频率和带菌率最高的为曲霉，分别为25%～60%和3.33%～10.00%；其次为镰刀菌，分离频率为25%～37.5%，带菌率为3.33%～5.00%。而种子外部带菌率较高的毛壳菌和木霉均没有分离到。

2.3 种子携带镰刀菌致病力的鉴定

本研究从菜豆种子表皮分离到25株镰刀菌，其中3株致病，引起菜豆苗根基部腐烂，种传病原分离频率为12%；而在菜豆种子内部分离到了7株镰刀菌，其中1株能够引起菜豆根部腐烂，种传病原分离频率为14.29%。由此说明，菜豆种子上携带的镰刀菌以腐生菌居多，种子检验中需要进一步的接种试验验证其致病力。

表3 种子上携带镰刀菌对菜豆植株致病力鉴定

品种 种子表皮携带镰刀菌 种子内部携带镰刀菌 编号致病菌株数目编号致病菌株数目白花架豆S1～S61I1,I21白玉满架S7～S162I3～I5083-B架豆S17～S220—/—0双丰1号S23～S250I6,I70

表4 致病镰刀菌对4种药剂的毒力测定

药剂名称EC50(mg/L)S3S7S13I110%苯醚甲环唑水分散粒剂0.972±0.1071.815±0.31814.033±3.0510.978±0.15170%甲基硫菌灵可湿性粉剂44.275±8.09621.461±3.18993.372±12.108121.915±15.132250g/L吡唑醚菌酯乳油176.251±12.147128.03±13.43395.321±9.782101.76±14.12625g/L咯菌腈悬浮种衣剂1.906±0.5312.173±1.0420.596±0.0450.963±0.053

2.4 不同杀菌剂对菜豆致病镰刀菌室内毒力测定

本研究采用室内菌丝生长速率法测定4种常用的种子处理药剂苯醚甲环唑、甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯和咯菌腈对菜豆种子上分离到的镰刀菌的抑制作用。试验结果表明，4种药剂对镰刀菌的抑制作用具有显著的差异，其中，25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂对菜豆种子上分离得到的4株致病镰刀菌抑制作用较强，EC50为0.596～2.173 mg/L。250 g/L吡唑醚菌酯乳油对镰刀菌抑制作用较弱，EC50为95.321～176.251 mg/L。10%苯醚甲环唑水分散粒剂和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂对镰刀菌有一定抑制作用，但不同菌株之间EC50值差异较大。

3 结论与讨论

种子带菌是田间病害主要初侵染源之一，导致病害的逐年发生危害和远距离传播。种子表面或内部携带病原真菌，均可随种子萌发而侵染[9-10]。种子表面与内部带菌具有很大相关性。一般病原真菌先附着于种子表面，然后再逐渐侵入种子内部、或侵染萌发后的幼芽、幼根。刘西莉等对不同水稻品种进行种子带菌检测，发现不同种子外部带菌差异较大，而内部带菌差异不大[11]。陈玉森等对红麻种子携带真菌的研究果发现，种子携带真菌多多为腐生菌，少数病原菌，可引起苗期炭疽病、灰霉病和枯萎病的发生[13]。

大量菜豆种子携带真菌的分类鉴定试验证明，菜豆种子上携带病原真菌的数量和种类较少，分离到的主要病原菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)[12]和腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)[13]，同时也分离到其它种的非致病镰刀菌，而其他致病菌分离到较少[14-15]。鉴于近年来菜豆根腐病在我国发生危害较重，病原菌初侵染源不明的现状，本研究开展菜豆种子携带真菌的检测。通过显微观察和平板分离培养检测到菜豆种子上存在2个种传病原属种镰刀菌属(菜豆根腐病菌)和链格孢属(菜豆黑斑病菌)，4个主要的腐生菌曲霉、青霉、木霉和毛壳菌。其中，镰刀菌的分离频率较高，与程美仁[7]1988年对菜豆种子携带真菌的研究报道结果一致。

种子包衣、药剂浸种是预防种传病害发生减轻其危害的高效、简便、经济的措施，在生产上发挥重要的作用[16-17]。本研究初步测定了4种常用的种子处理化学药剂对菜豆种子携带病原镰刀菌的抑制作用，测定结果显示，25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂对4株病原镰刀菌的抑制作用最强，可以作为有效的种子处理药剂选择，而250 g/L吡唑醚菌酯乳油对镰刀菌抑制作用较弱，生产上不宜选用。杀菌剂的包衣、浸种处理可以对种子表面携带的真菌进行有效的消毒，从而抑制种传病原的萌发危害，对种传病害的发生与流行具有有效的控制作用，建议在播种前选择适合的药剂做好菜豆种子消毒处理。