朱俊平 李龙 曾燕

摘要：目的 优选黄连蛋白质最佳提取方法，比较分析野生与种植黄连不同部位的蛋白质差异。方法 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝法，以蛋白质条带丰度、蛋白质相对分子量、每克样品中蛋白质含量为指标，比较3种提取方法（水提法、Tris-HCl法、硫酸铵沉降法）所得黄连蛋白质的差异，并对野生与种植黄连不同部位蛋白质的差异进行分析与评价。结果 优选得出黄连蛋白质最佳提取方法为Tris-HCl法，所得黄连蛋白质丰度最高，且每克药材中蛋白质含量最高。野生与种植黄连不同部位的蛋白质有明显差异，蛋白质丰度及每克药材中蛋白质含量均为：种植黄连根茎>野生黄连根茎>种植黄连茎叶>野生黄连茎叶>种植黄连须根。聚类分析结果显示，野生与种植黄连根茎蛋白质关联关系较为显著。结论 本研究优选的Tris-HCl法可充分提取黄连中的蛋白质；黄连根茎蛋白质含量明显高于其他部位。

关键词：黄连；蛋白质；聚丙烯酰胺凝胶电泳；考马斯亮蓝法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.015

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0061-05

Abstract： Objective To optimize the extraction method of Coptidis Rhizoma protein； To compare and analyze the differences of protein in different parts of wild and cultivated Coptidis Rhizoma. Methods SDS-PAGE gel electrophoresis and Coomassie brilliant blue method were used to compare the differences of the protein of Coptis chinensis from the 3 extraction methods （water extraction， Tris-HCl and ammonium sulfate precipitation）， and the protein in different parts of the wild and cultivated Coptis chinensis， and analyzed and evaluated the differences. Results The optimum extraction method of Coptis chinensis protein is Tris-HCl method， and the protein content of Rhizoma Coptidis is the highest， and the content of protein is the highest in every gram of medicinal material. The differences among different parts of wild and cultivated Coptidis Rhizoma were obvious， and the ranks for protein abundance and protein content per gram were： rhizome of cultivated Coptis chinensis > rhizome of wild Coptis chinensis > stem and leaf of cultivated Coptis chinensis > stem and leaf of wild Rhizoma Coptidis > fibrous roots of cultivated Coptidis Rhizoma. Cluster analysis showed that the correlation between protein of wild and cultivated rhizome of Coptidis Rhizoma was obvious. Conclusion The optimum Tris-HCl method can extract the protein from Coptidis Rhizoma， and the protein content of roots of Coptidis Rhizoma is significantly higher than other parts.

Keywords： Coptidis Rhizoma； protein； SDS-PAGE； Coomassie brilliant blue method

植物類中药的各种成分均为其原植物体的初级、次级代谢产物，这些代谢物都是沿生源代谢途径生物合成而来[1]。如果把握了生源代谢途径，不但可人为调节中药成分含量高低、实现中药质量可控性，而且可以模拟体外仿生合成、实现中药有效单体的可持续大批量获得技术，解决名贵稀缺中药资源短缺问题等[2-5]，因此，揭示中药原植物体的生源代谢途径具有重大的科学意义。欲揭示中药中原植物生源代谢途径，须先廓清中药原植物中的总蛋白及酶系间、蛋白酶与成分间，以及蛋白与药材部位间的关系。

黄连为毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎[6]，主产于四川、湖南、贵州、陕西、湖北等地，具有清热燥湿、清心除烦、泻火解毒功效。黄连含有多种生物碱，主要成分为小檗碱，还有黄连碱、药根碱、甲基黄连碱等[7]。因黄连产地分布较广，炮制品种较多，质量不易控制，目前采用HPLC、超高液相色谱法[8]、HPLC-电喷雾电离-串联质谱法[8]测定主要生物碱评价黄连的内在质量。

随着分子生物学的快速发展，分子鉴定技术越来越广泛应用于植物差异蛋白的比较[9-11]，但迄今利用差异蛋白质鉴别药用植物质量鲜有报道。因此，本研究以黄连植株为对象，通过筛选次生代谢产物量高的重庆（种植）和湖南崀山（野生）的优质黄连，优选黄连的蛋白提取方法，同时，采用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）垂直电泳技术和聚类分析方法，分析野生与种植黄连不同部位的差异蛋白，以期建立黄连植物体中黄连小檗碱的生源代谢途径，为确保优质药材种植资源及质量控制研究提供依据。

1 仪器与试药

TU-1900双光束紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），EPS300电泳仪（Tanon），VE-180垂直电泳槽（Tanon），TS-A脱色摇床（金坛市中大仪器厂），EKUP-11-20T超纯水机（长沙市科临电子科技有限公司），IMS-40全自动雪花制冰机（常德市雪科电器有限公司），SB-5200 DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），H1850R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），YP1002N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）。

新鲜黄连样品为实地采集，野生黄连（未知年限黄连，多为单只，细瘦弯曲，状如蝎尾）、种植黄连（6年生黄连，根状茎黄色，微弯曲如蚕状，具较长的“过桥”）均由湖南中医药大学石继连教授鉴定为毛茛科黄连属黄连Coptis chinensis Franch.。及时对鲜品黄连各部位进行前处理，将种植根茎、种植须根、种植茎叶、野生根茎、野生茎叶（野生黄连植株须根极短而少，故根茎和须根不进行分离）分别贮存于-80 ℃冰箱。

盐酸小檗碱对照品（批号110713-200208），中国食品药品检定研究院；四甲基乙二胺（BR，批号20150930），国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris，UP），Solarbio；1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.8），北京鼎国晶盛生物技术有限责任公司；1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 6.8），Wellbioscience；β-Mercaptoethanol，Sigma；溴酚蓝（Ind），国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（BR，98%），源叶生物；考马斯亮蓝G250（FMP），国药集团化学试剂有限公司；丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、过硫酸铵、冰醋酸、磷酸、甲醇、50%戊二醛、氨水、95%乙醇、无水乙醇、甲醛溶液、甘油、甘氨酸、柠檬酸、硝酸银、氢氧化钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 电泳样品缓冲液的制备

1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.8）0.5 mL，50%甘油0.4 mL，10%SDS 0.8 mL，β-Mercaptoethanol 0.2 mL，0.05%溴酚蓝0.1 mL，超纯水1.0 mL，混匀。

2.1.2 蛋白质标准溶液的制备

精确称取牛血清白蛋白10.0 mg，用超纯水溶解后定容至100 mL，即得100 ?g/mL蛋白质标准溶液，4 ℃冰箱保存[12]。

2.1.3 考马斯亮蓝染液的制备

精确称取考马斯亮蓝G-250 100.0 mg，加入95%乙醇50 mL溶解，再加入85%磷酸100 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，过滤，置于棕色试剂瓶中，备用[13]，最终溶液含0.01%考马斯亮蓝G-250、4.7%乙醇、8.5%磷酸。

2.2 不同部位植物总蛋白提取方法优选

新鲜植物蛋白常用提取方法有水提法、Tris-HCl法、硫酸铵沉降法，分别用3种方法提取种植根茎、野生根茎，比较其提取黄连蛋白质的优劣。

2.2.1 蛋白质提取

2.2.1.1 水提法

取新鲜植物体，剪碎，加6倍量超纯水，冰水浴勻浆，超声提取1.5 h，4 ℃离心，取上清液，加入等体积40%蔗糖溶液，混匀，于-20 ℃贮存[14]。

2.2.1.2 Tris-HCl法

取新鲜植物体，剪碎，于冰水浴研钵中加6倍量Tris-HCl缓冲液（pH 8.8）匀浆，冰水浴超声提取1.5 h，4 ℃离心，取上清液，加入等体积40%蔗糖溶液，混匀，即得植物总蛋白提取液，于-20 ℃贮存[15]。

2.2.1.3 硫酸铵沉降法

取新鲜植物体，剪碎，于冰水浴研钵中加6倍量Tris-HCl缓冲液（pH 8.8）匀浆，冰水浴超声提取1.5 h，4 ℃离心，取上清液，加固体硫酸铵至饱和度80%，静置后于-20 ℃加入预冷的80%丙酮，-20 ℃过夜，离心，取沉淀，-20 ℃挥净丙酮，Tris-HCl缓冲液（pH 8.8）溶解，于-20 ℃贮存[16]。

2.2.2 蛋白质SDS-PAGE垂直电泳

试验考察了8%、10%、12%、15%分离胶，3%、5%浓缩胶，60、80 V浓缩胶电压，80、100、120、150 V分离胶电压，10、15、20 ?L点样量在SDS-PAGE中的电泳效果，最终选择SDS-PAGE凝胶电泳条件为：12%分离胶与0.5 cm左右5%浓缩胶，垂直电泳槽在浓缩胶中电压为80 V，进入分离胶电压调至120 V，点样量20 ?L。采用银染色法染色，比较3种方法提取的种植根茎、野生根茎蛋白质，结果见图1。

SDS-PAGE结果显示，不同提取方法对蛋白质的提取、分离有很大影响，水提法、Tris-HCl法、硫酸铵沉降法均可得到一定量的蛋白质，Tris-HCl法所得蛋白质丰度最高、稳定、清晰，水提法和硫酸铵沉降法所得蛋白质浓度低且蛋白丰度较低。

2.2.3 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

2.2.3.1 标准曲线的绘制

分别取100 ?g/mL蛋白质标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，各加考马斯亮蓝染液4 mL，并用超纯水定容至10 mL，混匀，即得0、1、2、3、4、5、6 mg/L牛血清白蛋白标准品溶液[17]，用1号管进行700～500 nm全波长扫描，选定最大吸收波长595 nm，以0号管为空白对照，测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程A=0.048 82C+0.016 48，r=0.999 1。

2.2.3.2 3种提取方法的蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法测定水提法、Tris-HCl法、硫酸铵沉降法所得蛋白质含量，结果见表1。可见，3种提取方法对蛋白质的提取量有很大差别，所提取蛋白质的含量均为Tris-HCl法>水提法>硫酸铵沉降法，种植根茎和野生根茎均以Tris-HCl法提取所提取的植物总蛋白含量最高。因此，Tris-HCl法是提取黄连总蛋白的最佳方法。

2.3 黄连不同部位蛋白分析

2.3.1 电泳样品制备

取种植根茎、种植须根、种植茎叶、野生根茎、野生茎叶，采用Tris-HCl法提取，分别制得植物总蛋白母液。分别取5种总蛋白母液500 ?L，各加入电泳样品缓冲液100 ?L，混匀，于100 ℃水浴5 min，取出，放至室温，即得野生与种植黄连不同部位蛋白电泳样品。

2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用“2.2.2”项下优选的SDS-PAGE电泳条件分析Tris-HCl法提取的野生与种植黄连不同部位（种植根茎、种植须根、种植茎叶、野生根茎、野生茎叶）蛋白电泳样品在相对分子量分布上的差异，结果见图2。

结果显示，野生与种植黄连不同部位蛋白质的相对分子量主要分布在34～10 kD。种植根茎在34～10 kD有3条多量蛋白质，且在72～55 kD有1个蛋白条带；种植须根仅在34～26 kD有1个较浅条带；种植茎叶在34～10 kD有3条蛋白条带，在72～55 kD有1个较浅蛋白条带；野生根茎在34～17 kD有大量蛋白质，在72～55 kD有1个较浅蛋白条带；野生茎叶仅在34～26 kD有1个较深条带。野生与种植黄连不同部位所含蛋白质种类及蛋白质含量差别明显，蛋白质条带丰度为：种植根茎>野生根茎>种植茎叶>野生茎叶>种植须根。

2.3.3 总蛋白含量测定及聚类分析

分别取种植根茎、种植须根、种植茎叶、野生根茎、野生茎叶蛋白样品溶液200 ?L，加入考马斯亮蓝染液4 mL，蒸馏水定容至10 mL，混匀，静置15 min，在595 nm波长处测定吸光度，代入“2.2.3.1”项下标准曲线方程，并计算不同部位样品蛋白质含量。结果每克样品中蛋白质含量依次为：种植根茎（7.485 6±0.146 8）>野生根茎（6.310 3±0.138 1）>种植茎叶（4.061 7±0.158 9）>野生茎叶（3.013 6±0.156 2）>种植须根（2.255 4±0.173 9）。采用SPSS21.0软件对结果数据进行聚类分析，见图3。可以直观看出，野生与种植黄连根茎蛋白关联关系较为顯著，与其他部位蛋白关联不显著。野生与种植黄连根茎的蛋白含量明显高于其他部位，且6年生种植黄连根茎蛋白含量高于野生未知年限黄连根茎。

3 讨论

蛋白质的提取是蛋白质组学研究的首要步骤，其提取蛋白的优劣直接影响蛋白质表达分析的研究及其结果的准确性。本试验考察了3种常用的中药材蛋白质提取方法对野生与种植黄连蛋白提取浓度和丰度的影响，结果显示，黄连蛋白提取浓度和丰度均为Tris-HCl法优于水提法、硫酸铵沉降法，Tris-HCl法所提取的黄连蛋白条带数目最多、条带最清晰，每克样品中蛋白质含量最高，且操作步骤简单，因此选择Tris-HCl法作为黄连蛋白质的提取方法。本试验采用的SDS-PAGE和考马斯亮蓝法在蛋白亚基分布、相对分子量及蛋白质定量时分析效率高、操作简便、测定结果准确可靠，具有一定的可行性。

本试验通过Tris-HCl法提取的野生与种植黄连根茎蛋白质浓度和丰度比较显示，6年生种植黄连根茎的蛋白质浓度和丰度略高于野生未知年限黄连根茎。说明野生黄连的质量不一定优于种植黄连，也可能由于野生黄连为未知年限黄连，而种植黄连为6年生黄连，其有效成分含量差异受生长年限影响。

本试验对黄连植株不同部位进行分离并对其蛋白质进行分析和评价。种植黄连不同部位的蛋白质丰度及每克样品中蛋白质含量均为：种植黄连根茎>种植黄连茎叶>种植黄连须根，表明种植黄连植株的蛋白质差异明显，根茎部位高于须根和茎叶部位。野生黄连不同部位的蛋白质丰度及每克样品中蛋白质含量均为：野生黄连根茎>野生黄连茎叶，表明野生黄连植株的蛋白质差异明显，根茎部位远高于茎叶部位。通过黄连植株的蛋白质丰度及含量分析可对黄连植株的不同部位进行鉴别，对黄连及其产品的市场质量进行控制。

本试验对野生和种植黄连不同部位蛋白质含量测定结果进行聚类分析，将样品按照品质特性相似程度逐渐聚合在一起，最终按照类别的综合性质使其分类聚合，可知野生与种植黄连根茎蛋白关联关系较为显著，与其他部位蛋白关联不显著。

本试验优选了黄连蛋白质的提取方法，建立了野生与种植黄连不同部位蛋白质的分子鉴别方法，比较了黄连不同部位蛋白差异，为其初级、次级代谢成分及代谢途径研究奠定基础，也可为黄连药材种质资源研究及分子质量控制评价提供依据。

参考文献：

[1] 吕海舟，刘琬菁，何柳，等.植物次生代谢基因簇研究进展[J].植物科学学报，2017，35（4）：609-621.

[2] YANG D F， LIU F L， YANG X L. DNA methyltransferase inhibitor dramatically alters the secondary metabolism of Pestalotiopsis microspora[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2017， 26（5）：355-359.