郑洁 赵莉平 胡亚莉

摘要：目的 观察不同剂量青藤碱对兔膝骨关节炎模型关节软骨中Toll样受体（TLR）2、4和髓样分化因子88（MyD88）表达的影响，探讨其相关作用机制。方法 采用Hulth法建立膝骨关节炎模型。实验兔随机分为空白组、模型组和青藤碱低、中、高剂量组，空白组不予任何处理，模型组和青藤碱低、中、高剂量组膝关节腔分别注射生理盐水和0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg）青藤碱，共干预10次。实时荧光定量PCR和Western blot检测关节软骨TLR2、TLR4和MyD88的mRNA和蛋白表达。结果 模型组TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表达较空白组均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，青藤碱中、高剂量组TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表达均显著下调（P<0.05，P<0.01）。结论 青藤碱可通过下调TLR/MyD88通路中关键分子的表达抑制兔膝骨性关节炎软骨免疫反应。

关键词：青藤碱；骨关节炎；固有免疫；Toll样受体；髓样分化因子88；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章編号：1005-5304（2018）09-0049-03

Abstract： Objective To observe the effects of different doses of sinomenine on toll-like receptor （TLR）2， TLR4 and myeloid differentiation factor 88 （Myd88） in cartilage of rabbit knee osteoarthritis model； To discuss its mechanism of action. Methods Knee osteoarthritis model was established by Hulth method. Experimental rabbits were randomly divided into control group， model group， sinomenine low-， medium- and high-dose groups. Blank group received no processing. Model group， sinomenine low-， medium- and high-dose groups received intra-articular injection of normal saline and sinomenine 0.2 mL （5 mg）， 0.35 mL （8.75 mg） and 0.5 mL （12.5 mg） respectively， for 10 times. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in cartilage. Results mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in model group significantly increased compared with control group （P<0.01）； compared with model group， mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in sinomenine medium- and high-dose groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Sinomenine can inhibit the cartilage immune response of rabbit knee osteoarthritis by down-regulating expressions of key molecules in the TLR/MyD88 pathway.

Keywords： sinomenine； osteoarthritis； innate immune； toll-like receptor； myeloid differentiation factor 88； rabbits

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是由增龄及生物力学机制改变等因素引起的以关节软骨损伤为中心，并累及病变关节周围多种组织的退行性关节病。近年研究发现，包括炎性反应及固有免疫反应在内的生物学因素在OA发病中发挥了重要作用，OA滑膜炎性反应很可能是软骨损伤激活机体固有免疫反应后出现的继发过程，与OA的发生与进展紧密联系在一起[1]。青藤碱是从防己科藤本植物青风藤中提取的生物碱单体，为青风藤的主要活性成分，具有镇痛、消炎及免疫抑制等作用。课题组前期研究发现，青藤碱可抑制OA滑膜炎性反应，对关节软骨具有保护作用[2]。本实验以“固有免疫参与OA”为切入点，观察不同剂量青藤碱对兔膝OA模型关节软骨中Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）2、4和髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）等TLR/MyD88通路中关键分子表达的影响，从免疫学角度探讨青藤碱干预OA的相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物

新西兰大白兔50只，雌雄各半，体质量2.0～2.4 kg，西安交大医学院实验动物中心，动物合格证号SCXK（陕）2014-003。标准饲料喂养，室温20～25 ℃，相对湿度45%～60%，正常光照，自由摄食饮水。

1.2 药物、主要试剂与仪器

正清风痛宁注射液（主要成分为盐酸青藤碱），湖南正清制药集团股份有限公司，批号1607405。β-actin、TLR-2、TLR-4和MyD88引物（南京金斯瑞生物科技有限公司），TLR2、TLR4和MyD88多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），RNA提取试剂盒及qPCR反应试剂盒（北京全式金公司）。AB7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司），湿式转移电泳槽（美国BioRad公司），NanoDrop 2000C紫外分光光度计（美国Thermo公司），凝胶成像仪（美国BioRad公司）。

1.3 造模、分组及给药

采用Hulth法[3]建立兔膝OA模型，术后6周随机处死2只兔，行关节软骨病理学检查，结果显示典型软骨退变，表明造模成功。将50只新西兰大白兔随机分为空白组、模型组和青藤碱低、中、高剂量组，青藤碱低、中、高剂量组膝关节腔分别注射正清风痛宁注射液0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg），模型组注射0.2 mL生理盐水，以上4组每3 d干预1次，共干预10次，空白组不予处理。

1.4 标本采集

兔耳缘静脉空气栓塞法处死所有实验动物，小刀仔细刮取右膝关节面软骨，一部分保存于装有RNA保存液的EP管，另一部分置于普通EP管，-80 ℃冰箱保存，分别留待qRT-PCR和Western blot实验。

1.5 qRT-PCR检测Toll样受体2、4和髓样分化因子88 mRNA表达

用RNA提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测定纯度和浓度，应用RNA反转录试剂盒反转录、合成第一链cDNA，最后于荧光定量PCR仪上进行扩增。操作方法均严格按照试剂盒说明进行。所有qRT-PCR设4个复孔，并设阴性对照，实验重复3次，结果以2–ΔΔCt表示。引物序列见表1。

1.6 Western blot检测Toll样受体2、4和髓样分化因子88蛋白表达

将100 mg软骨提取总蛋白后，以BCA法检测定量，计算上样量，SDA-PAGE凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，将一抗用封闭液稀释并4 ℃过夜，TBST洗涤3次，于二抗工作液中室温孵育1 h，TBST洗涤后加入ECL显色液中，室温振荡，反应5 min，暗室中曝光、显影、定影。使用Image J软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析，蛋白表达水平以目的条带与内参β-actin条带平均吸光度的比值表示。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组数据间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青藤碱对模型兔软骨Toll样受体2、4和髓样分化因子88 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组兔软骨TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，青藤碱中、高剂量组兔软骨TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。见表2。

2.2 青藤碱对模型兔软骨Toll样受体2、4和髓样分化因子88蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组兔软骨TLR2、TLR4和MyD88蛋白表达显著升高（P<0.01）；與模型组比较，青藤碱中、高剂量组兔软骨TLR2、TLR4和MyD88蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。见表3、图1。

3 讨论

固有免疫系统的激活主要依赖于对来自体内病原或损伤组织的保守序列的识别[4]。OA滑膜炎的发生机制与类风湿关节炎具有相似性，可能是软骨损伤激活机体固有免疫反应后出现的继发过程[1]。关节创伤、长期过度使用和增龄均可造成关节软骨细胞及细胞外基质的破坏，并释放能够激活体内固有免疫系统的损伤相关性分子（damage-associated molecular patterns，DAMP）[5]。OA关节内的DAMP主要有蛋白及蛋白多糖的碎片、细胞崩解的残留物[6]。固有免疫受体又被称为模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR），PRR通过识别DAMP引发组织无菌性炎症。TLR是PRR的一种，除广泛存在于各类免疫细胞，TLR还可表达于OA病变软骨和滑膜成纤维细胞[7]。OA患者软骨损伤区域TLR2和TLR4的表达量显著高于常人[8]。MyD88是TLR信号通路重要的下游分子，大多数TLR（TLR3除外）均通过MyD88途径激活核因子-κB（NF-κB），引起组织中相应炎性介质的合成和释放。青风藤来源于防己科植物青藤或毛青藤的干燥根茎，具有通络、止痛、祛风湿的功效，主治风湿及类风湿关节炎、关节肿大、肢体疼痛、麻木等。现代药理研究表明，青藤碱是青风藤中主要的活性生物碱，具有祛风镇痛、消炎、免疫抑制、降压及抗心律失常等作用[9]。文献报道，青藤碱可抑制类风湿关节炎患者外周血树突状细胞TLR2/4的表达及NF-κB的活性，提示其对TLR/MyD88信号通路介导的固有免疫具有抑制作用[10-11]。

本实验结果显示，兔膝OA模型关节软骨TLR2、TLR4和MyD88的表达显著上调，中、高剂量青藤碱可显著下调兔膝OA模型关节软骨中TLR2、TLR4和MyD88的表达，低剂量青藤碱作用不明显。这一结果表明，青藤碱有抑制OA固有免疫反应的作用，其机制与下调TLR/MyD88信号通路关键分子的表达相关。

参考文献：

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[10] 余克强，罗仁.青藤碱对类风湿性关节炎患者外周血树突状细胞TLR2和TLR4表达的影响[J].中华中医药杂志，2009，24（3）：316-319.

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（收稿日期：2018-03-21）

（修回日期：2018-04-23；编辑：华强）

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