杜 清，秦民坚*，吴 刚

（1.青海民族大学药学院，青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海 西宁 810007；2.中国药科大学中药资源学研究室，江苏 南京 210038；3.青海省药物分析重点实验室，青海 西宁 810007）

明党参（Radix Changii）为伞形科明党参属单种植物明党参（Changium smyrnioides Wolff）的干燥根[1]，是国家二级濒危保护植物[2]，主产于江苏、安徽、浙江等地[3]，陈建伟等[4]从明党参中首次分得胆碱。氯化胆碱（choline chloride）与正常脂肪代谢和运转有关，是一种抗脂肪肝因子的有效成分，用于肝炎、早期肝硬化、脂肪肝等的辅助治疗剂[5]，氯化胆碱60%水剂、50%可湿性粉剂可用作蛋鸡生产等的饲料添加剂[6]，氯化胆碱有诸多的功效和实际作用，故借鉴GB/T17481-1998中的方法并应用正交实验法筛选和优化胆碱类功效成分[7，8]，为今后更好地应用明党参药材中的胆碱成分提供切实可行的依据。现报告如下。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

明党参药材采购于安徽亳州药材市场，经中国药科大学秦民坚教授鉴定为伞形科明党参Changium smyrnioides Wolff.的干燥根，粉碎过筛60目备用。

1.2 试剂和仪器

氯化胆碱标准品购于中国药品生物制品鉴定所：雷氏盐：Sigma Aldrich of D-89552/Fluka chemie；硝酸（南京化学试剂一厂），甲醇（江苏汉邦科技有限公司）；正丙醇（上海凌峰化学试剂有限公司），氢氧化钠（上海凌峰化学试剂有限公司）；丙酮（天津市博迪化工有限公司），水浴锅（国华电器有限公司），循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；UV-2501可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 5%雷氏铵盐甲醇溶液的配制

将雷氏盐5 g溶解在100 mL甲醇中超声即得，放于冰箱中保存。

1.3.2 氯化胆碱标准液的配制

精密称取105℃干燥至恒重的氯化胆碱标准品200 mg，置于200 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（即浓度为1 mg/mL）。

1.3.3 比色及最大吸收波长的确定

取氯化胆碱对照品溶液加入适量5%雷氏铵盐甲醇溶液，静置析晶，滤取结晶，丙酮溶解，UV-2501分光光度计作全波长扫描，确定最大吸收峰及波长。

1.3.4 标准曲线的制作

分别取氯化胆碱标准液2，4，6，8，10，12，14，16，18 mL，分别加水至20 mL，再加入5%雷氏铵盐甲醇夜各5 mL，冰箱放置生成胆碱雷氏盐结晶。滤取结晶，用正丙醇洗三次，丙酮溶出，定容至25 mL，在520 nm波长处测定吸光度，以含量（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.5 样品溶液中胆碱的测定

称取60℃干燥的小样10 g，硝酸加热回流分解提取，滤液用40%的氢氧化钠调节PH至9～10，加入过量甲醇，冰箱放置1夜，滤液浓缩加入雷氏铵盐甲醇溶液，生成粉红色片状结晶，用正丙醇清洗，丙酮溶解结晶后定容至25ml容量瓶中，吸取5 mL用丙酮定容至25 mL容量瓶，在520 nm处测定吸光度，由氯化胆碱标准曲线方程计算氯化胆碱的浓度C，并计算样品中胆碱的百分含量：胆碱含量（mg/100 g）=C*0.746*稀释倍数/称样量*100；

式中：0.746为胆碱系数。

1.4 提取工艺的初步设想

将工艺提取条件考虑设计如下：

（1）提取时所用酸水的浓度：常用0.1～1.0%的酸水液提取，因此选择0.1%，0.5%，1.0%的硝酸溶液；（2）提取时间：文献中会用7小时，故选择3小时，5小时和7小时；（3）提取所用酸水的体积：5倍，10倍和20倍；（4）提取次数：1次，2次和3次。

1.5 提取工艺的正交设计

对2.6中的条件采用四因素三水平的正交表L9（34），见表1，考察使用紫外分光光度法测得氯化胆碱的含量来筛选最佳条件。

表1 正交实验因素水平表

2 结 果

2.1 标准曲线及线性范围

以浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制的标准曲线如图1所示，回归方程式为：A=0.0098+1.2393C，r=0.9986，说明氯化胆碱标准品溶液在0.08～0.72 mg/mL与其吸光度成线性相关。

2.2 提取工艺正交实验的结果

按照2.7的正交实验设计方法测定明党参药材中氯化胆碱的含量，结果详见表2。

图1 氯化胆碱标准品溶液的标准曲线图谱

表2 明党参药材中氯化胆碱的提取工艺正交实验结果表（n，%）

2.3 提取工艺正交实验结果的方差分析

根据3.2的正交实验结果，进行方差分析，结果见表3。

表3 明党参中氯化胆碱含量的方差分析

表3选择方差最小的B作为空白对照，从方差分析结果可看出各个因素对明党参中氯化胆碱的提取工艺影响的大小分别为A＞C＞D＞B而且最优化的方案为A2B2C3D1。

2.4 提取工艺正交实验的直观分析图

2.4.1 酸浓度对明党参中胆碱提取的影响

根据提取工艺结果，从图2中可看出，酸浓度最合适为0.5%时提取出的明党参胆碱得率最高。

2.4.2 提取时间对明党参中胆碱提取的影响

根据提取工艺结果，从图3中可看出，提取时间最合适为2小时，提取出的明党参胆碱得率最高。

图2 酸浓度对明党参中胆碱提取的影响

图3 提取时间

2.4.3 所用酸浓度对对明党参中胆碱提取的影响

根据提取工艺结果，从图4中可看出，所用酸体积20倍时，提取出的明党参胆碱得率最高。

图4 提取出的明党参胆碱所用酸体积

2.4.4 提取次数对明党参中胆碱提取的影响

根据提取工艺结果，从图5中可看出，提取1次提取出的明党参胆碱得率最高。

图5 提取次数对明党参中胆碱提取的影响

2.4.5 明党参中氯化胆碱提取的优化工艺条件

根据明党参中氯化胆碱提取的正交实验结果和方差分析，可得其最优化工艺条件为：明党参粉末于60℃干燥粉碎后用0.5%，20倍的硝酸溶液加热回流分解提取1次，每次5小时，滤液用40%NaOH溶液调节PH至9～10，加入过量甲醇，冰箱放置过夜，抽滤后得滤液，浓缩加入雷氏铵盐甲醇溶液，生成粉红色片状结晶，将此结晶溶解后定容，紫外分光光度测定即可得到氯化胆碱的含量。

2.5 明党参中氯化胆碱提取优化工艺条件的验证试验

按照3.5的优化工艺条件提取三批明党参药材样品并测定其中氯化胆碱的含量，见表4。

表4 明党参中氯化胆碱提取工艺的验证试验

由表4中的工艺验证实验结果可得明党参药材中氯化胆碱的平均得率为（37.02±2.8）%，RSD偏差＜3.0%，说明该工艺稳定可行。

3 讨 论

对明党参中胆碱的提取工艺进行摸索，从实验结果可得出A2B2C3D1为最合适的提取分离条件；从四个因素水平（酸水液的浓度、提取时间、提取所用酸水的体积、提取次数）的直观分析图也佐证了明党参的最佳提取工艺条件如3.5中所总结出的结论，由优化后的工艺进行样品验证，相对标准偏差较小，说明该工艺稳定可行，可适用于明党参中氯化胆碱的提取分离。