向萍霞 张池 胡晞江 汪明

1华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）（武汉430016）；2武汉大学人民医院检验科（武汉430060）

妊娠不足28周、胎儿体重不足1 000 g而终止者，称为流产，发生在妊娠12周前者称为早期流产。胚胎着床后31%发生自然流产（spontaneous abortion，SA），其中80%为早期流产［1］，有2次及2次以上流产经历的被称为复发流产（recurrent miscarriage，RM）。染色体异常是自然流产最常见的原因［2］，45%～70%的偶发性流产是基因异常引起的，在复发性流产中的比例为25%～57%［3］。微阵列比较基因组杂交技术（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）是一种高效的全基因组范围分析拷贝数变异（copy number variants，CNVs）的分子诊断工具，被认为是传统细胞核型分析的有力替代工具［4］，并且无需进行细胞培养，分辨率高。将aCGH芯片应用于临床检测流产绒毛，国内外都有文献报道［5-8］，应用该技术除了可以检测出染色体异常外，还可以检测出微缺失和微重复序列，也就是拷贝数变异（CNVs）。

有文献报道SA组和RM组在染色体异常（类型和组成）的遗传背景上有统计学差异［9］，他们的研究只采用的传统的细胞核型分析，由于方法学的限制，有可能漏掉一些未检测出的异常，我们采用Affimetrix公司的CytoScan optima全基因组芯片，对120例临床诊断的早期自然流产及复发流产的绒毛组织进行检测，旨在更全面的探讨早期流产和复发流产的遗传背景差异。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2016年6月至2017年12月间在武汉市妇幼保健院就诊的患者，收集不明原因早期流产和复发流产组织物120例，孕周6～12周。患者年龄22～41岁，平均（31.28±5.17）岁，孕次1～4次。早期流产组58例，复发流产组62例，患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 Array-CGH检测方法应用Affimetrix公司的CytoScan optima全基因组芯片扫描技术检测全基因组CNVs。按试剂盒说明书操作，先后加入20 μL Protease K溶液、200 μL样本和200 μL缓冲液AL，震荡混匀后56℃温育10 min，加入200 μL无水乙醇，漂洗2次；加入配制好的消化试剂消化，随后加入配制的连接试剂连接，然后进行PCR扩增、提纯、定量，加入片段化试剂进行DNA片段化处理；将DNA溶液标记后加入杂交试剂95℃10 min后，49℃孵育至少10 min，加200 μL 处理好的样本载入到芯片中，置于密闭杂交盒中50℃16～18 min进行杂交反应；洗染芯片后扫描分析。用Affimetrix GeneChip Scaner生成原始文件，通过AGCC软件芯片图像显示分析，利用软件Affimetrix Chromosome Analysis SuiteSoftware分析结果。

1.2.2 统计学方法早期流产和复发流产的遗传背景统计学差异采用χ2检验（Fisher′s确切概率法），以P＜0.05为差异有统计学意义，统计软件是SPSS 19.0。

2 结果

2.1 Array-CGH基因分析结果120例早期流产和复发流产绒毛样本全部成功获得芯片检测结果，成功率100%。检测出异常染色体67例，异常率为55.8%（67/120）。其中以非整倍体为最多，共62例，检出率为51.7%（62/120）。CNVs有7例，检出率为5.8%（7/120），其中单纯性CNVs 4例，非整倍体合并CNVs 2例。还检出1例单亲二倍体（UPD）。芯片结果统计见表1。

表1 120例流产绒毛array-CGH基因芯片分析结果Tab.1 Array-CGH results of 120 cases choronic villus samples例

2.2 早期流产和复发流产的芯片结果差异比较（按年龄分组）将120例早期流产和复发流产绒毛样本的芯片检测结果按照年龄分组，进行组间结果的详细比较，在各组间均未发现差异具有统计学意义的差异，见表2。

3 讨论

3.1 绒毛染色体微阵列比较基因组杂交检测成功率高传统的流产绒毛检测方法由于受细胞污染的影响，有的样本绒毛细胞无法成功贴壁，检测成功率不高，笔者实验室的检出率为51.9%［10］。Array-CGH芯片可以直接对流产绒毛提取DNA进行检测，不需要进行细胞培养，成功率为100%。

3.2 全基因组拷贝数变异（CNVs）微阵列比较基因组杂交技术（array-based comparative genomic hybridization，array-CGH）是近几年开始在临床上应用的一种高效的分子核型分析技术，无需进行细胞培养，直接提取DNA样本进行全基因组拷贝数变异（copy number variants，CNVs）检测，并将变异准确定位到染色体上，达到基因水平检测。CNVs是指在人类基因组中广泛存在的从1 000碱基对（base pairs，bp）到数百万bp范围的缺失、插入、重复和复杂多位点的变异，表现为二倍体重复或者三倍体重复以及缺失。重复或缺失的CNVs可改变基因的结构，进而对其表达产生影响，可能引起相应的病理表型。CNVs目前分为致病性CNVs、非致病性CNVs以及临床意义不明确的CNVs三类。本研究中所采用的Affymetrix公司的芯片是全球唯一通过FDA/CFDA/CE认证的基因芯片扫描系统，本研究采用的CytoScan optima全基因组芯片总共包含315 608个探针，覆盖对照、拷贝数（copy number，CN）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）探针。其中总共有180，18个CN和148 450个SNP标记，在基因组中均匀分布，并重点加密了396个产前相关的基因区域。通过SNP和非多态性探针的结合，此芯片可应用于产前及流产物样本中CNVs的检测，等位基因不平衡的检出等。本研究中检测出异常染色体67例，异常率为55.8%（67/120）。其中以非整倍体为最多，共62例，检出率为51.7%（62/120）。CNVs有7例，检出率为5.8%（7/120）。其中有位于DiGeorge Syndrome疾病区域的致病性 CNVs［11］；有临床意义不明确［12］，位于Xp22.31区的1.68 Mb片段重复，该片段也有报道为可引起严重神经系统疾病［13］等几种CNVs。总体来看，本研究检测出的变异率比李颖等［5］报导的比例（10/43）低，可能是因为他们的研究中包含死胎的样本。GAO等［4］对早期自然流产的绒毛染色体进行了常规细胞培养、FISH和aCGH检测的方法学比对研究，他们报道在100例样本中，培养失败14例，FISH和aCGH检测成功率都是100%，他们只检测出1例CNVs。其余结果中 16-三体、21-三体、18-三体、22-三体以及45，X单体、性染色体异常的三倍体等的检出率和本研究都比较相似。他们认为微小突变在他们的研究结果中比例不高，可能是由于有些微小突变并无致死性。SHEN等［14］对436例绒毛样本进行aCGH和第二代测序的全基因组对比研究，他们测出的CNVs比例为5.3%（23/436），和我们的结果5.8%是比较接近的。邢长英等［15］通过高通量基因测序技术对胚胎停育行清宫术的绒毛组织进行分析，认为流产组织中，微重复占81.3%，微缺失仅占18.8%，提示胚胎染色体的微重复可能更容易影响胚胎早期发育，导致妊娠早期的胚胎停育。本研究中检测出1例单亲二倍体（uniparental disomy，UPD），是同源染色体来自同一亲体的情况。UPD在人群中的发生率大概为1/3 500［16］。对于UPD，即使采取常规培养制片成功，核型报告只能报告46，XX，不能检测出异常，只能用分子遗传学方法予以诊断和分析。本研究中有1例临床诊断为“胎儿宫内发育迟缓”的样本，经芯片检测全基因组范围内未见明显基因缺失。“胎儿宫内发育迟缓”现称“胎儿宫内生长受限”，有母体和胚胎两方面因素影响，本研究中只涉及一例，后续研究将扩大样本进行深入探讨。

表2 早期流产和复发流产的芯片结果差异比较（按年龄分组）Tab.2 Comparison of distribution of genomic results in SA and RM by maternal age 例（%）

3.3 早期流产和复发流产的遗传背景无显著性差别CHOI等［9］在2014年对自然流产和复发流产的细胞培养和核型分析的报道认为：自然流产和复发流产的细胞遗传学背景存在显著差异。他们的研究由于采用的是传统的细胞培养和核型分析，因而在文章中已经说明一部分培养失败的案例没有纳入。另外，他们的报道中孕周范围包括20周的绒毛，纳入病例的孕周范围比本研究广。他们的研究中也报道10周以内的早期流产和复发流产的细胞遗传背景差异无统计学意义。本研究采用基因芯片的检测方法，对12周以内的早期流产和复发流产的分子遗传背景进行检测，认为无差异性，和CHOI等的研究结论基本一致。

综上所述，array-CGH可直接对流产物提取DNA进行检测，克服了传统核型分析细胞培养失败，中期染色体制备不理想等缺点，对于UPD也能检测出来，为临床咨询流产原因提供了一种更有效地遗传学检测方法。HARDY等［17］通过文献检索分析比较了FISH、CGH、SNP、qPCR、QF-PCR等分子遗传学方法，认为在培养失败时，aCGH是最好的选择。MASSALSKA等［3］也直接指出array-CGH芯片检测是目前临床检测流产绒毛是否存在基因异常最有效的方法。本研究采用array-CGH芯片对12周以内的早期流产和复发流产的分子遗传背景进行检测，认为没有显著差异，因为研究中总共纳入120例病例，CNVs的检出率不高，可以下一步扩大样本量做进一步的研究。