胡赞 孙锐 程方雄 曾吉 叶俊

武汉市第四医院，华中科技大学同济医学院附属武汉普爱医院1检验科，2肿瘤内科（武汉430077）

胰腺癌是一种恶性程度极高的恶性肿瘤，5年生存率不足8%［1］。在我国胰腺癌引起的病死率占所有恶性肿瘤死亡原因的第6位，且发病率以每年2.3%的速度递增［2］。细胞周期依赖激酶抑制剂 3（cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）为双特异性蛋白磷酸酶家族成员，可使CDK1/2去磷酸化并失活［3-4］。据报道，CDKN3表达异常与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，但其在胰腺癌中的表达鲜有报道［3-4］。本研究旨在探讨CDKN3在胰腺癌中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2010年1月至2016年6月我院及湖北省肿瘤医院行胰腺癌根治术的初诊胰腺癌患者29例，取癌组织及配对癌旁组织（距离肿瘤边缘5 cm以上），其中男17例，女12例，平均年龄为58.2岁。所有患者术前均未接受放化疗及靶向治疗，且经术后病理学明确诊断。

1.2 生物信息学检索访问并下载GEO数据集中胰腺癌GSE28735数据，分析CDKN3 mRNA在癌及癌旁组织表达差异性。

1.3 Western blot检测CDKN3蛋白表达用PIPA蛋白裂解液裂解细胞，提取总蛋白并测定蛋白含量。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转膜，待封闭、洗膜后依次与一抗、二抗孵育，洗膜后曝光检测。鼠抗人CDKN3单克隆抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体，HRP标记的二抗购自美国Thermo公司。

1.4 免疫组织化学染色取手术切除的胰腺癌及癌旁组织，经固定、脱水、透明、包埋、切片、烤片、抗原修复、封闭后，依次加入一抗、二抗孵育后显色。由两位病理科医师采用盲法判定阳性。CDKN3主要定位于细胞浆，阳性呈现棕黄色或棕褐色。

1.5 细胞培养与转染吉玛生物科技有限公司设计和合成CDKN3 siRNA，其序列如下5′-AAAC-CACCAGUGUUAUCAAUU-3′；对照siRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′［4］。取对数生长期细胞运用Lipofectamine2000（invitrogen）试剂盒进行转染，参照试剂盒说明书进行操作。

1.6 细胞迁移实验取对数生长期细胞制成悬液，Transwell小室上室加细胞悬液及血清培养基各 100 μL，下室加 800 μL 完全培养基，培养 24 h后取出并弃液、固定、染色，冲洗后用显微镜观察。

1.7 统计学方法使用SPSS 17.0进行统计学分析，细胞迁移率比较采用两独立样本t检验；CDKN3表达与临床特征的关系分析采用Fisher精确概率检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学访问GEO数据集胰腺癌GSE28735数据库，通过统计学分析发现胰腺癌组织CDKN3 mRNA表达水平明显高于配对癌旁组织（图1）；生存分析结果显示，高CDKN3表达胰腺癌患者生存期显著低于低CDKN3表达患者（图2），即高CDKN3表达提示预后不良。

图1 CDKN3 mRNA在胰腺癌及配对癌旁组织表达水平Fig.1 CDKN3 expression level in pancreatic cancer tissue and adjacent tissue in database GSE28735

图2 生存分析结果Fig.2 Survival analysis results

2.2 胰腺癌组织CDKN3蛋白的表达Western blot检测29例配对胰腺癌和癌旁组织中CDKN3蛋白的表达。结果显示，其中23例（79.3%）胰腺癌组织CDKN3蛋白表达水平显著高于癌旁组织（图3），差异有统计学意义（P＜0.01）。

图3 4例配对的腺胰癌组织（T）及癌旁组织（N）中CDKN3蛋白表达情况Fig.3 The expression of CDKN3 in 4 paired pancreatic cancer tissues and adjacent tissues

2.3 CDKN3蛋白在胰腺癌组织中的表达CDKN3蛋白阳性反应主要定位于细胞质。免疫组化结果显示，在29例配对组织中的21例，CDKN3在胰腺癌组织中表达水平显著高于癌旁组织（图4）。

图4 CDKN3在胰腺癌及癌旁组织中的表达（×400）Fig.4 Representative photographs of staining of CDKN3 protein in a pair of pancreatic cancer and adjacent tissues

2.4 细胞迁移实验体外运用si-RNA敲低Panc-1胰腺癌细胞系中CDKN3的表达，使用Transwell小室检测CDKN3敲低表达对细胞迁移能力的影响。结果显示，CDKN3敲低显著降低Panc-1胰腺癌细胞的迁移能力（P ＜0.01）（图5）。

2.5 胰腺癌组织CDKN3表达水平与临床特征的关系将29例癌组织CDKN3表达水平排序，并取高、低CDKN3表达样本各14例，分析CDKN3表达水平与临床特征之间的关系。结果显示CDKN3表达水平与胰腺癌患者性别、年龄均无关；高CDKN3表达患者淋巴结转移比率高、TNM分期高（P ＜ 0.05）（表1）。

3 讨论

CDKN3被证实参与调节细胞周期过程［5］。研究证实，CDKN3在乳腺癌［4］、胃癌［6］、前列腺癌［7］中高表达，并通过不同的信号通路，调节癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等细胞生物学行为。CDKN3在乳腺癌中可作为原癌基因，通过靶向抑制下游PCNA、RhoA及Bcl-2的表达，调控细胞乳腺癌细胞的增殖、迁移及细胞周期［4］；此外，在胃癌细胞中敲低CDKN3可降低CDK2、CDC25A、CCNB1及CCNB2等下游基因的表达，可降低癌细胞的增殖、迁移、侵袭和黏附能力，并可诱导癌细胞阻滞于G0～G1期［6］；在前列腺癌中，CDKN3表达水平与患者生存率呈显著负相关；敲低其表达可显著促进细胞停滞在G1期，癌细胞凋亡率升高、侵袭能力降低。

图5 转染CDKN3 siRNA后Panc-1细胞迁移能力变化Fig.5 Cell migration was assessed by transwell assay in Panc-1 cells after transfected with CDKN3 siRNA

表1 CDKN3在胰腺癌组织中的表达与部分临床特征的关系Tab.1 Correlation between the CDKN3 expression and the clinicopathologic features of the pancreatic cancer例

有趣的是，CDKN3在一些恶性肿瘤中表达上调，而在另一些恶性肿瘤中表达下调。CDKN3被证实在肝癌［8］及胶质母细胞瘤［9］中表达缺失或下调。CDKN3表达水平与肝癌的病理分期呈显著负相关，抑制其表达可显著增强肝癌细胞的克隆能力及对化疗药物的耐受能力［8］。敲低CDKN3表达可导致p53和p21表达下调，而AKT1激酶表达上调。CDKN3可能通过AKT/P53/P21信号通路增强肝癌细胞生存能力［8］。

本课题组首次利用生物信息学预测，并通过实验证实胰腺癌组织CDKN3表达水平明显高于配对癌旁组织；此外通过迁移实验证实，敲低CDKN3显著降低胰腺癌细胞的迁移能力；最后统计分析得出，高CDKN3表达提示高淋巴结转移率及高TNM分期，高表达CDKN3提示胰腺癌患者预后不良。本课题组后期拟深入探索CDKN3调控胰腺癌细胞迁移转移的分子机制，为胰腺癌的治疗提供理论基础。