刘凯歌 吴方雄 卫银银 闵亚莉 苗向霞 罗正奇

西安医学院第一附属医院消化内科（西安 710077）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第六大常见肿瘤，其病死率占癌症第二位［1］。而乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是我国HCC的主要原因。研究［2］表明HBV DNA X基因编码的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）在乙肝相关性肝癌的发生发展、侵袭及转移中起关键作用。人血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）是一种分泌型糖蛋白，在脂肪和肝脏组织中分布较多［3］，研究［4-5］发现其与肿瘤的血管生成和转移密切相关。乙肝相关性肝癌中HBx与ANGPTL4的关系如何，国内外鲜有报道。本文通过研究HBx和ANGPTL4在乙肝相关性肝癌组织中的表达及HepG2-X中ANGPTL4的蛋白水平，探讨其对乙肝相关性肝癌的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料69例乙肝相关性肝癌组织标本由西安医学院第一附属医院及空军军医大学西京医院病理科提供，均为2014年1月至2017年1月经手术切除病例，术前均未行放、化疗及其他辅助治疗。人正常肝细胞株QZG、肝癌细胞HepG2及HepG2-X为空军军医大学西京医院肿瘤生物学国家重点实验室保存，其中HepG2-X为转染了HBx基因的HepG2细胞。鼠抗人HBx单克隆抗体（美国NeoMarkers公司），兔抗人ANGPTL4多克隆抗体、小鼠单克隆抗体GAPDH及蛋白Marker（英国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测SP法检测按常规步骤进行，鼠抗人HBx单克隆抗体滴度1∶400，兔抗人ANGPTL4多克隆抗体滴度1∶200。以磷酸盐缓冲液作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。每张切片随机选择5个视野，依据每个视野中阳性细胞百分比和染色强弱进行评分：仅对细胞核着蓝色者为阴性，胞膜、胞浆或胞核呈棕黄色者为阳性。阳性细胞＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。0分为阴性，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳性。两项之和≤3分为阴性，＞3分为阳性。

1.2.2 细胞培养人正常肝细胞株QZG、肝癌细胞株HepG2及HepG2-X细胞培养于10%胎牛血清和青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL的DMEM培养基，置37℃、0.5%CO2培养箱常规培养。

1.2.3 Western blot检测收集对数生长期细胞后常规裂解，收集上清，95℃蛋白变性、定量及电泳。利用SDS-PAGE分离目标蛋白。电泳后转膜，100 g/L脱脂奶/TBS缓冲液封闭；兔抗人ANGPTL4抗体滴度1∶1 000，小鼠抗GAPDH抗体滴度1∶2 000，4℃孵育过夜；洗涤，HRP-标记的山羊抗兔二抗，室温孵育2 h，洗涤，ECL显色，X线胶片感光。

1.3 统计学方法采用SPSS 18.0软件处理数据，计数资料用χ2检验，计量资料以±s表示，两均数比较用t检验，两变量之间采用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBx和ANGPTL4在乙肝相关性肝癌组织的表达及相关性免疫组化检测HBx和ANGPTL4在乙肝相关性肝癌组织中的表达（图1），69例乙肝相关性肝癌组织中HBx阳性表达率为68.11%（47/69），ANGPTL4阳性表达率为63.76%（44/69）；HBx阳性组ANGPTL4的阳性表达率76.95%（36/47）明显高于HBx阴性组ANGPTL4的阳性表达率36.35%（8/22）（P ＜ 0.05）；Spearman相关分析表明，HBx与ANGPTL4的表达呈正相关（r=0.31，P ＜0.01）。

图1 免疫组化检测HBx和ANGPTL4在乙肝相关性肝癌组织的表达（SP，×400）Fig.1 Expression of HBx and ANGPTL4 in HBV related hepatocellular carcinoma were detected by immunohistochemistry（SP，× 400）

2.2 乙肝相关性肝癌组织中HBx及ANGPTL4表达与肝癌临床病理学特征的关系统计分析发现HBx及ANGPTL4在乙肝相关性肝癌组织中阳性表达与患者的年龄、性别、肿瘤直径、包膜浸润无关，而与门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期有关（P＜0.05）；其中TNM分期Ⅰ/Ⅱ期组病例中，HBx阳性表达率为60.46%（26/43），显著低于Ⅲ/Ⅳ期组的80.76%（21/26）（P ＜ 0.05）；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期组病例中，ANGPTL4阳性表达率为58.13%（25/43），显著低于Ⅲ/Ⅳ期组的73.07%（19/26）（P ＜ 0.05）。见表1。

2.3 Western blot结果在HepG2-X中，ANGPTL4蛋白表大水平与转染空载体的肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞系QZG相比显著升高（图2）。

3 讨论

HCC是高发病率、高病死率的恶性肿瘤，但发生机制仍不明确。其发生发展是一个多阶段、多因素和多分子参与的复杂过程。流行病学和分子生物学认为HBV感染是HCC发生的高危因素，其中HBV中X基因编码的HBx被认为是乙肝相关性肝癌中重要的多功能病毒调控蛋白，通过调控基因转录、参与信号转导、调控细胞增殖和凋亡在HCC的发生发展、侵袭、转移及血管生成中发挥着重要的作用［2，6］。研究［7］发现，HBx通过激活一系列细胞内信号通路与肿瘤微环境中的肝星状细胞、免疫细胞、炎性因子及细胞外液相互作用，促进HCC的发生进展、侵袭及转移。HCC具有双重血液供应系统，是典型的富血供的恶性肿瘤。它的发生、发展、转移及复发离不开新生血管的生成。尽管目前在肝癌血管生成方面的研究取得了很大的突破，但主要针对单个血管生成相关分子的作用，没有进行系统或网状研究。本课题组前期工作提示HBx与HCC新生血管生成关系密切，参与的肝癌血管生成，并与多种血管生成的细胞因子相关［8-10］。本课题组前期通过基因芯片技术筛选出HBx参与肝癌血管生成的差异表达基因，发现643条差异表达基因，其中UBR3、ATXN3、ANGPTL4等19条基因经HBx干预后表达量明显上升，FOLR1、HSPs、ZNF等624条明显下降，提示HBx可能对ANGPTL4在肝癌血管生成中具有调节作用［10］。因此，本研究选择二者作为研究因子。ANGPTL4属于血管生成素样蛋白家族一员，与肿瘤细胞的生长、迁移、浸润和血管生成密切相关，促进癌细胞血管通道形成，为肿瘤提供血供。ANGPTL4在舌鳞状细胞癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌及乳腺癌中的血清水平或组织表达较对照组明显升高［11-15］。同样在肝癌患者中，ANGPTL4 mRNA表达和蛋白水平较高，敲除或中和ANGPTL4明显抑制肝癌MHCC-97细胞转移，因此，ANGPTL4与肝癌的生长、转移关系密切。

表1 HBx及ANGPTL4表达与乙肝相关性肝癌临床病理学特征的关系Tab.1 Relationship of HBx and ANGPTL4 in HBV related hepatocellular carcinomawith clinicopathological characteristics 例

图2 Western blot检测人QZG肝细胞、HepG2细胞和HepG2-X细胞中ANGPTL4的表达Fig.2 The expression of ANGPTL4 in QZG，HepG2 and HepG2-X were detected by Western blot

本研究中，乙肝相关性肝癌组织中HBx阳性率为68.11%，ANGPTL4阳性率为63.76%，HBx阳性组ANGPTL4的阳性表达率明显高于HBx阴性组ANGPTL4的表达率（P＜0.05）；相关性分析表明二者呈正相关。同时发现，HBx和ANGPTL4表达与门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期密切相关（P＜0.05）。其中，TNM分期高的乙肝相关性肝癌中HBx和ANGPTL4的表达均较高（P＜0.05）。说明二者可能在乙肝相关性肝癌的发生、发展、转移及血管生成中发挥着协同作用。有研究表明肝癌组织中ANGPTL4的mRNA表达和蛋白水平较高，且淋巴结转移及肿瘤恶性度与ANGPTL4的表达密切相关［16］。而笔者通过Western blot检测发现，HepG2-X中ANGPTL4蛋白水平较人正常肝细胞系QZG及肝癌细胞HepG2显著升高。本课题组前期通过transwell共培养技术也发现［17］，HBx促进了ANGPTL4的表达，二者均提示在乙肝相关性肝癌的发生发展中，ANGPTL4高表达与HBx相关；HBx可能通过促进ANGPTL4的表达诱导肝癌的发生发展、侵袭及转移，ANGPTL4高表达反映其预后不良。

因此，HBx和ANGPTL4表达上调可能是肿瘤发生发展的重要生物事件，与乙肝相关性肝癌的侵袭、转移密切相关，二者呈正相关，HBx可能通过正向调控ANGPTL4的表达，诱导乙肝相关性肝癌的侵袭与转移，而HBx调控ANGPTL4的具体信号通路有待进一步研究。