王丽萍, 崔雅欣, 徐 佳, 侯雨菲, 吐伦阿依·艾合买提, 王嘉琪, 王立成

(1. 吉林大学 生命科学学院, 长春 130012; 2. 吉林大学 化学学院, 长春 130012)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)是我国少数民族的常用药材[1], 具有抗炎、 抗氧化、 降压、 补益等多种生物活性, 且无明显的毒副作用[2]. 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans, 简称线虫)是一种无毒无害、 可独立生存的线虫. 因其个体小、 生命周期短、 繁殖迅速等特点, 常作为模式生物广泛应用. 线虫经历4个阶段的幼虫期(L1,L2,L3,L4)后变为成体. 其生活环境温度恒定, 20 ℃时生命周期约为20 d. 采用尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(EscherichiacoliOP50)培养线虫, 具有培养条件简单、 生活周期短等优点. 作为第一个获得全基因组序列的生物, 线虫40%以上的基因与人类基因同源, 且因其遗传背景清楚、 个体结构简单、 生活史短、 基因组测序完成等优势, 在遗传与发育生物学、 衰老与寿命、 药物筛选等领域应用广泛[3-5]. 本文提取余甘子的活性成分, 并以线虫为模型考察其抗氧化作用.

1 材料与方法

1.1 仪 器

生化培养箱(SHP-160型, 上海三发科技仪器有限公司)； 超净工作台(SW-CJ-1FD型, 苏州净化设备有限公司)； 高速低温离心机(Centrifuge 58-10R型, 德国Eppendorf公司)； 手动移液器(德国Eppendorf公司)； 紫外-可见光分光光度计(UV-2501PC型, 日本岛津公司)； 旋涡混合器(XW-80A型, 上海精科实业有限公司).

1.2 材料与试剂

缺陷型大肠杆菌； 野生型秀丽隐杆线虫(Bristol N2)； 余甘子； 胰蛋白胨, 酵母提取物(日本Gentihold公司)； 无水乙醇、 CaCl2,NaCl,MgSO4,NaH2PO4(分析纯， 北京化工厂)； KCl,NaHCO3(分析纯, 大连美仑生物有限公司)； 琼脂粉、 磷酸二氢钾、 胆固醇(分析纯, 上海化学试剂公司)； 次氯酸钠溶液(分析纯, 天津南开化工厂)； 超氧化物歧化酶测试盒(T-SOD， A001-1型, 南京建成生物工程研究所).

1.3 方 法

1.3.1 余甘子的提取和成分鉴定 参考文献[6-7], 将0.8 g余甘子粉末溶于50 mL去离子水中, 充分振荡, 37 ℃静置过夜后, 于4 000 r/min离心8 min, 取上清液, 于8 000 r/min二次离心30 min, 合并上清液, 用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描, 设置扫描参数为200～800 nm, 用超纯水调基线.

1.3.2 产卵量实验 挑取雌雄同体线虫进行同期化培养, 至L4期. 每组3只线虫, 挑至相应线虫生长培养基(NGM)平板中. 在20 ℃培养箱内恒温培养, 每天更换培养基, 为方便和准确计数虫卵个数, 于线虫第一次产卵的3 d后计数, 直至线虫产卵结束. 设置4个实验组： 对照组、ρ(余甘子)=1.0,2.0,4.0 mg/mL给药组. 重复3次.

1.3.3 线虫移动能力的测定 随着线虫虫龄的增长, 当线虫进入生命晚期时, 其移动速度减慢, 参考文献[8-9]测定线虫的移动能力. 线虫的移动情况主要分为4个等级： A级线虫具有正常的身体移动能力； B级线虫的移动状态非正常或触碰时移动； C级线虫在触碰时仅头部摆动； D级线虫已死亡. 选取同期化L4期线虫每组70只于相应板中, 20 ℃培养箱内恒温培养, 每24 h转移至新板中, 直至线虫全部死亡. 记录给药后线虫每日的运动情况, 并进行统计.

1.3.4 寿命实验 挑取同期化成虫第一天的线虫, 每组60只, 挑至已加药的各组, 在20 ℃恒温培养箱中培养. 同期化线虫从卵孵化开始记为0 d, 通常线虫产卵一般持续8 d, 所以在给药初期即L4期, 每天将待测线虫更换新的NGM板, 以防止卵及幼虫发育而干扰测定. 待成虫不再产卵后每2 d更换一次NGM板. 用挑虫器轻轻触碰线虫, 若无任何反应, 则记为死亡线虫. 因虫袋死亡或遗失的线虫记为丢失线虫. 按天转移线虫至新的给药板中直至所有线虫死亡. 在喂食线虫第四天进行寿命实验, 每天记录线虫的存活数. 设置2个实验组： 对照组和ρ(余甘子)=1.0 mg/mL实验组. 重复3次.

1.3.5 H2O2氧化损伤实验 随机选择10只同期化的雌雄同体线虫, 转移至含有新鲜E.coliOP50的NGM平板上, 过夜. 第二天挑取成虫, 于20 ℃培养3 d后, 每组选择40只新孵化的成虫转移至含20 mmol/L H2O2的NGM平板上, 每小时统计存活率. 设置4个实验组： 空白组、ρ(余甘子)=0.5,1.0,2.0 mg/mL实验组, 均置于20 ℃培养箱内培养孵育, 重复3次.

1.3.6 热激实验 L4期线虫经同期化后给药3 d, 更换至新的NGM中, 密封后在35 ℃恒温培养箱中培养至线虫全部死亡. 每小时统计存活率, 以触碰产生响应的线虫数与线虫总数的比值表征. 侧壁上脱水死亡的线虫记为丢失, 不参与统计. 重复3次.

1.3.7 检测超氧化物歧化酶(SOD)表达量 同期化的L4期线虫, 每组80只线虫正常给药培养, 每日转至新培养基表面. 20 ℃恒温培养4 d后, 用M9缓冲溶液收集线虫于1.5 mL EP管中； 离心清洗3次, 各组线虫悬于0.5 mL M9缓冲溶液中； 用300 W功率超声裂解线虫, 每个循环时间20 s, 10～20个循环完成线虫裂解. 按照T-SOD测试盒(南京建成生物)说明书要求, 一次加入应用液、 样品、 底物、 缓冲液并进行充分混匀, 于37 ℃温浴40 min后加入显色剂, 室温放置10 min, 采用紫外-可见分光光度计在550 nm波长处测定吸光度, 用超纯水进行基线调零, 计算活力.

1.3.8 数据统计 采用GraphPad软件对数据进行统计分析, 以(平均值±标准差)表示, 采用Student’sT-test进行显著性检验.

2 结果与分析

2.1 余甘子提取物分析

余甘子提取物的紫外全波长扫描结果如图1所示. 由图1可见, 在213,270 nm处有明显的强吸收峰, 表明余甘子提取物的主要成分为黄酮类化合物[6].

图1 余甘子提取物的紫外全波长扫描结果Fig.1 Results of ultraviolet whole wavelength scanning of P.emblica L.extracts

2.2 线虫衰老相关指标检测

2.2.1 余甘子提取物对线虫产卵量的影响 线虫产卵期从L4期至8 d龄. 实验从L4期开始给药余甘子提取物(ρ=1.0,2.0,4.0 mg/mL), 考察其对线虫正常生殖能力的影响[10-11]. 空白组及余甘子给药组线虫产卵量的统计分析如图2所示. 由图2可见, 余甘子提取物在虫龄4～7 d均表现出较对照组显著促生殖的作用, 在产卵期后期仍存在较明显的促生殖作用, 且ρ(余甘子)=1.0 mg/mL给药组显著高于空白组的产卵总量； 高质量浓度给药组(4.0 mg/mL)存在一定程度的促生殖作用, 但与对照组差别较小, 可能是由于过高质量浓度余甘子提取物的毒物兴奋作用干扰线虫正常繁殖所致. 因此, 余甘子提取物可显著提高线虫的日产卵及总产卵量.

2.2.2 余甘子提取物对线虫移动能力的影响 通过评价线虫运动能力可直观观察线虫处于生命周期的何种时期, 并评价线虫衰老进程[10-11].图3为线虫给药后第3,6,9,12天的行为能力水平变化趋势. 由图3可见, 与对照组相比, 给药组未出现影响肌肉收缩功能的情况, 且ρ=1.0,4.0 mg/mL给药组的线虫较同龄对照组行为更活跃, 死亡线虫较少； 中等质量浓度(2.0 mg/mL)给药组有一定的保护作用, 但与对照组差别较小, 进一步表明在实验的给药质量浓度范围内, 余甘子提取物对线虫毒性作用较低.

图2 余甘子提取物对线虫产卵量的影响Fig.2 Effects of P.emblica L.extracts on spawning of C.elegans

a,b,c. ρ(余甘子)=1.0,2.0,4.0 mg/mL; d. 对照.图3 余甘子提取物对线虫运动能力的影响Fig.3 Effects of P.emblica L.extracts on exercise capacity of C.elegans

2.2.3 余甘子提取物对线虫寿命的影响 余甘子提取物对线虫寿命的影响结果如图4所示. 由图4可见,ρ(余甘子)=1.0 mg/mL的给药组较对照组表现出明显的寿命延长作用(***p< 0.001). 因此, 以ρ=1.0 mg/mL为最适质量浓度, 考察余甘子提取物对线虫抗压力保护作用的影响.

2.2.4 余甘子提取物对线虫抗氧化损伤能力的影响 同期化的L4期线虫进行ρ(余甘子)=0.5,1.0,2.0 mg/mL给药培养3 d后, 统计分析H2O2损伤条件下线虫存活情况, 结果如图5所示. 由图5可见, 1.0 mg/mL余甘子给药组与对照组相比, 在H2O2损伤条件下对线虫有极显著的保护作用(***p<0.001);ρ(余甘子)=0.5,2.0 mg/mL给药组在线虫后期有一定的保护作用, 但与对照组差别较小.

图4 余甘子提取物对线虫寿命的影响Fig.4 Effects of P.emblica L.extracts on life of C.elegans

图5 H2O2损伤条件下余甘子提取物对线虫存活率的影响Fig.5 Effects of P.emblica L.extracts on survival rate of C.elegans under condition of H2O2 damage

2.2.5 余甘子提取物对线虫热抵抗能力的影响 在35 ℃热激条件下, 余甘子提取物对线虫的保护作用如图6所示. 由图6可见, 1.0 mg/mL余甘子提取物提高了线虫抗热激能力(*p<0.05), 表明1.0 mg/mL余甘子提取物对线虫具有抗热激诱导的氧化压力保护作用.

2.2.6 SOD表达含量检测 余甘子提取物对线虫体内SOD表达的影响如图7所示. 由图7可见, 1.0 mg/mL余甘子提取物喂食线虫显著高于空白对照组SOD的相对含量(**p<0.01), 表明余甘子提取物喂食线虫体内的超氧化物歧化酶高表达, 从而可提升对线虫在H2O2及热激等氧化压力诱导条件下的抗氧化保护作用.

图6 余甘子提取物对线虫热抵抗能力的影响Fig.6 Effects of P.emblica L.extracts on heat resistance of C.elegans

图7 余甘子提取物对线虫SOD表达的影响Fig.7 Effects of P.emblica L.extracts on SOD expression of C.elegans

综上所述, 本文以余甘子为研究对象, 以秀丽隐杆线虫为模型, 考察了余甘子提取物的抗氧化作用, 通过抗衰老指标评估表明, 余甘子提取物具有显著的抗氧化功效. 较低质量浓度(ρ=1.0 mg/mL)的余甘子提取物可显著延长线虫的寿命, 提高线虫的产卵量、 移动能力以及体内酶活性, 进而达到抗氧化的保护作用[12-13].