刘晓黎，王昌明，蒋 明，莫碧文

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系统常见病及多发病，特征是持续存在的呼吸道症状和气流受限，原因是气道和肺泡异常，通常与显著暴露于毒性颗粒和气体有关[1]，可通过积极预防和治疗改善其疾病进程。COPD发病机制并未完全明确，包括：异常炎症反应、氧化/抗氧化失衡、蛋白/抗蛋白酶失衡等，其中炎症机制尤为重要。气道、肺实质以及肺血管的炎症是COPD的主要病理特征，级联持续的炎症反应导致肺血管及气道重构，肺血管重构是COPD及肺动脉高压的重要病理基础。研究[2]表明在COPD早期的异常炎症反应中致炎因素、炎症过程及炎症介质已经开始参与肺动脉重构。核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是一种调控基因表达的DNA结合蛋白，生物活性广泛，多项研究证实NF-κB与COPD气道炎症、肺血管重构[3]密切相关。实验通过建立慢支、COPD、COPD并肺动脉高压动物模型，以NF-κB 特异性抑制剂吡喀烷二硫代氨基甲酸蓝(PDTC)作为工具药，观测NF-κB表达水平与COPD肺血管重构的关系，探讨PDTC在COPD疾病进展中的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料雄性健康SPF级SD大鼠48只，体质量(200 ±20) g，由桂林医学院动物实验中心提供，饲养环境为SPF级清洁实验室；脂多糖(LPS)、PDTC(美国Sigma公司)；黄果树牌烤烟型香烟(贵州中烟工业公司)；医用氮气、无水氯化钙及钠石灰；TRIzol、反转录Primescript RT reagent kit试剂盒、PCR SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(宝生物工程大连有限公司)；琼脂糖(美国Gene Tech公司)；NF-κB p65单克隆抗体、羊抗鼠IgG(美国Santa Cruz公司)；发光试剂盒(美国Thermo scientific公司)；自制有机玻璃舱，BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；OX-100A数字测氧仪(浙江南加分析仪器厂)；TKR-400H电脑小动物呼吸机(南昌新长征医疗科技发展有限公司)；IX71倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；T Personal 48基因扩增仪(德国Biometra公司)；Western blot凝胶电泳模具(美国Bio Rad公司)；Image-pro-plus6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)；凝胶成像分析系统(上海培清科技有限公司)。

1.2动物模型建立与分组随机将48只SD大鼠分为8组，实验组及PDTC药物干预组各4组，每组6只。制备动物模型，方法如下：实验组：① 正常对照组：正常饲养28 d后检测；② 慢支组：第1、14天经气道内注入LPS 200 μg/次，28 d后检测；③ COPD组：按照慢支组方法气道内注射LPS，同时每日香烟烟雾暴露1 h/d，共28 d；④ COPD并肺动脉高压组：按照COPD组方法，实验共42 d，最后14 d在香烟烟雾暴露的同时，给予18%低氧8 h/d。PDTC药物干预组:① 其中慢支干预组、COPD干预组、COPD并肺动脉高压干预组分别与其相对应的实验组模型制作方法相同，从第15天起予腹腔内注射PDTC，剂量为100 mg/(kg·d)；② PDTC药物干预空白对照组从第15天起予腹腔内注射与PDTC相等剂量的生理盐水。

1.3验证实验动物模型测定气道阻力、右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)、平均肺动脉压力(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)及观察肺组织病理改变，物模型制备完成第2天用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，调节小动物呼吸机，压力设定为6 kPa，通过颈部气管插管将大鼠连接于小动物呼吸机，利用压力传感器记录其气道阻力。后消毒暴露大鼠胸腔，采用肺动脉插管法，将连有压力换能器的导管插入肺动脉中，生物机能实验系统通过压力传感器记录肺动脉压力曲线、RVSP、mPAP。分离大鼠右肺中叶，浸入多聚甲醛固定24 h，距肺门2～3 mm处取材、切片，行HE染色和VG+维多利亚蓝染色，观察肺组织炎症浸润情况。

1.4评价肺血管重构指标肺组织切片行维多利亚蓝+VG染色，采用倒置荧光显微镜及 Image-pro-plus6.0图像分析系统进行数据测量及分析。观察肺血管重构相关指标：每例大鼠随意取5个视野，200倍镜下记录直径<100 μm的肺腺泡内动脉数量并进行分类,计算三型动脉构成比，即肌性动脉(muscular artery,MA)、部分肌性动脉(partially muscular artery,PMA)和非肌性动脉(nonmuscular artery,NMA)。400高倍镜下计算50 μm<直径<100 μm肌性动脉的管壁厚度与血管外径比( the ratio of vascular wall over external diameter,WT%)、管壁面积与血管总面积比(the ratio of vascular wall area over total area,WA%)。右心室肥厚指标：大鼠心脏放血后取出，剪除多余组织，分离右心室游离壁、左心室+室间隔，滤纸反复吸干后称重，计算右心室肥厚指数(the ratio of the weight of right ventricle/left ventricle and septum，RV/LV+S)值。

1.5检测肺组织内NF-κBmRNA、蛋白含量用RT-PCR半定量法测定mRNA含量，制备肺组织匀浆，加入TRIzol，提取总RNA，经凝胶电泳鉴定、保存。另取适量RNA测其吸光度值，计算RNA浓度。按照逆转录试剂盒操作方法，进行逆转录合成cDNA, 保存备用。加入引物序列、模板、DEPC水、设定反应条件后，进行NF-κB PCR扩增反应，再进行琼脂糖凝胶电泳。然后用凝胶成像分析系统测定每个目的条带及看家基因β-actin的光密度值,并计算目的基因与β-actin光密度值的比值。

Western blot法检测肺组织匀浆中NF-κB的表达，于肺组织匀浆中加入蛋白提取液，按照试剂盒步骤提取总蛋白并测定其浓度进行蛋白定量。经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离至硝酸纤维素滤膜,5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加一抗(1 ∶500稀释)、室温孵育1 h、PBST洗膜3次加入二抗(1 ∶1 000稀释)再孵育、洗膜、利用发光试剂盒发光、X线胶片暗室显影。通过凝胶成像分析系统扫描测定各目的条带及内参GAPDH的光密度值，计算其比值，代表NF-κB蛋白表达的相对含量。

2 结果

2.1验证实验动物模型

2.1.1气道阻力、mPAP、RVSP比较 与正常对照组比较，慢支组气道阻力、mPAP、RVSP无明显变化，COPD组及COPD并肺动脉高压组气道阻力、mPAP、RVSP均增高(F=26.329、19.362、13.249，P<0.05)；慢支组、COPD组、COPD并肺动脉高压组气道阻力依次增高(P<0.05)；COPD并肺动脉高压组RVSP比COPD组增高(P<0.05)，但两组间mPAP差异无统计学意义。PDTC干预后，COPD干预组较COPD组、COPD并肺动脉高压干预组较COPD肺动脉高压组mPAP、RVSP明显下降(t=2.673、3.864、2.712、3.841，P<0.05)。见表1。

2.1.2肺组织病理形态学改变 肺组织切片行HE、VG+维多利亚蓝染色染色后观察，相比正常对照组，慢支组小气道管壁可见炎症细胞浸润，支气管纤毛柱状上皮层见杯状细胞增生，管腔内炎细胞聚集及黏液分泌增多，平滑肌层未见增厚或断裂。COPD组气道腔内炎细胞聚集及黏液蓄积较慢支组更为明显，管壁内浸润大量炎症细胞，柱状上皮杯状细胞增生明显，平滑肌层增厚，部分肌层已经断裂，黏膜下及外膜见胶原纤维增生，同时有肺气肿形成，部分可见肺泡壁断裂形成肺大泡。VG+维多利亚蓝染色可见红染的胶原沉积多于正常对照组。COPD并肺动脉高压组病理组织学改变与COPD组相似，但气道管腔内及管壁炎症细胞浸润程度稍轻，平滑肌层增厚更为明显。经PDTC干预后， COPD干预组气道管壁炎症细胞浸润较COPD组减轻。COPD并肺动脉高压干预组炎症浸润，气道平滑肌层断裂、肺泡壁断裂程度较COPD并肺动脉高压组减轻。见图1、2。

2.2动脉构成比、肌性动脉WT%和WA%、RV/LV+S比较相比正常对照组，慢支组肺血管重构指标无明显改变，COPD组肌化型动脉百分比升高(F=2.663，P<0.05)，对直径在50～100 μm的肌化型动脉进行图像分析WA%、WT%比值无升高(F=22.53、28.856，P>0.05)；COPD并肺动脉高压组肌化型动脉百分比升高，WA%、WT%比值亦升高(P<0.05)。相比各实验组，COPD干预组、COPD并肺动脉高压干预组肌化型动脉百分比下降(t=5.285、8.179，P<0.05)。COPD并肺动脉高压干预组较COPD并肺动脉高压组WA%、WT%比值亦有所下降(t=2.852、3.65，P<0.05)。见表2、图2。 相比正常对照组，慢支组RV/LV+S无变化；COPD组、COPD并肺动脉高压组RV/LV+S值增高(F=3.995，P<0.05)，上述两组间差异无统计学意义。PDTC干预后，COPD并肺动脉高压干预组RV/LV+S较COPD并肺动脉高压组降低(t=2.663，P<0.05)。见表2。

表1 各组气道阻力、RVSP、mPAP比较

与对应实验组比较：*P<0.05；与正常对照组比较：#P<0.05

图1 肺组织病理学变化 HE×20

A：正常对照组；B：慢支组；C：COPD组；D：COPD并肺动脉高压组；E：干预空白对照组；F：慢支干预组；G：COPD干预组；H：COPD并肺动脉高压干预组

图2 肺小动脉结构变化 VG+维多利亚蓝×20

A：正常对照组；B：慢支组；C：COPD组；D：COPD并肺动脉高压组；E：干预空白对照组；F：慢支干预组；G：COPD干预组；H：COPD并肺动脉高压干预组

表2 肺血管重构相关指标、RV/LV+S分析

与对应实验组比较：*P<0.05；与正常对照组比较：#P<0.05；与COPD并肺动脉高压组比较：▽P<0.05

图3 肺组织NF-κB mRNA RT-PCR电泳图

M：Marker; A：正常对照组；B：慢支组；C：COPD组；D：COPD并肺动脉高压组；E：慢支干预组；F：COPD干预组；G：COPD并肺动脉高压干预组

2.3大鼠肺组织内NF-κBmRNA含量及蛋白含量

2.3.1肺组织NF-κB mRNA相对含量 相比正常对照组(0.187±0.054)，慢支组(0.240±0.054)NF-κB mRNA表达无明显变化(t=-1.739，P>0.05)，COPD组(0.331±0.048)较正常对照组(0.153±0.061)、COPD并肺动脉高压组(0.392±0.068较正常对照组(0.144±0.060)NF-κB mRNA表达显著增强(t=-5.613、-6.633，P<0.05)；同时COPD并肺动脉高压组(0.646±0.075)NF-κB mRNA表达明显强于COPD组(0.541±0.058)(F=70.779，P<0.05)。COPD干预组(0.243±0.051)较COPD组(0.331±0.048)、COPD并肺动脉高压干预组(0.288±0.069)较COPD并肺动脉高压组(0.392±0.068)NF-κB mRNA表达明显减弱(t=3.025、3.037，P<0.05)。见图3。

2.3.2肺组织NF-κB蛋白相对含量 相比正常对照组(0.832±0.202)，慢支组(0.822±0.208)NF-κB蛋白含量无显著变化，COPD组(1.657±0.230)较正常对照组(0.511±0.116)、COPD并肺动脉高压组(1.697±0.233)较正常对照组(0.517±0.118)NF-κB蛋白表达增强(t=-10.898、-11.062，P<0.05)。慢支组(0.376±0.117)、COPD组(0.801±0.177)、COPD并肺动脉高压组(1.550±0.203)NF-κB蛋白表达水平依次递增(F=73.857，P<0.05)。COPD干预组(0.874±0.147)、COPD并肺动脉高压干预组(0.895±0.190)NF-κB蛋白表达均较其实验组(1.657±0.230)、(1.697±0.233)减弱(t=17.795、5.949，P<0.05)。见图4。

3 讨论

感染、吸烟是COPD的两大主要致病因素。研究[4]显示慢性炎症、低氧因素与COPD的肺血管重构密切相关，最终导致肺动脉高压、慢性肺源性心脏病。本实验制备COPD各阶段动物模型，结果显示慢支组无气道阻力增高，病理切片见气道纤毛倒伏、黏连，杯状细胞增生，气管腔内炎细胞聚集和分泌物增多；COPD组气道阻力增高，管腔内炎细胞聚集及黏液蓄积，管壁内大量炎症细胞浸润，柱状上皮杯状细胞增生明显，平滑肌层增厚，黏膜下及外膜胶原纤维增生，部分肌层断裂，肺气肿形成，部分肺泡壁断裂形成肺大泡，mPAP、RVSP升高，RV/LV+S、肌化型动脉百分比增高；COPD并肺动脉高压组病理改变与COPD组相似，但气道管腔内及管壁炎症浸润程度稍轻，平滑肌层增厚更明显。上述模型病理学改变均与人类慢支、COPD的病理特征吻合，COPD组与COPD并肺动脉高压组分别代表COPD肺血管重构的不同阶段，COPD组代表早期阶段，表现为肌化型动脉百分比增多；COPD并肺动脉高压组代表肺血管重构进展，腺泡内肌化型动脉百分比增高，管壁厚度增加，WA%、WT%比值增高。

NF-κB属于Rel蛋白家族，广泛存在于真核细胞内，生物学功能包括参与炎症、免疫反应、氧化应激、细胞增殖及凋亡、自身的转录、细胞周期的调控、肿瘤的发生[5-6]等。NF-κB在气道炎症、血管重塑过程中至关重要[7-8]，是气道氧化应激的重要标志物之一，影响IL-1β、iNOS、COX-2、G-CSF、MCP-1等[9]炎症介质基因表达和释放，并通过反馈环路导致炎症过程的放大和持续。上述炎症介质可影响VFGF、TGF-β、FGF等的调节，进一步影响肺血管重构。本实验通过建立COPD相关动物模型，RT-PCR、Western blot检测显示COPD组、COPD并肺动脉高压组肺组织内NF-κB mRNA表达逐渐增强、蛋白含量逐渐增高；且NF-κB mRNA、蛋白的表达与肺血管重构相关指标变化一致。提示NF-κB表达与大鼠COPD疾病的发展关系密切。

PDTC是一种新型抗氧化剂，为NF-κB特异性抑制剂，主要通过泛素化蛋白酶降解途径影响NF-κB的核移位来抑制其活性[10-11]，PDTC能有效阻断NF-κB下游低氧诱导因子的激活，延缓COPD疾病的进展。章忠渭 等[12]发现PDTC能抑制重症急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB活化。Kan et al[13]等研究表明PDTC 可影响NF-κB、Fas、TNF-α等因子的活性，改善肺损伤。本实验借助PDTC为工具药，检测PDTC药物干预组NF-κB mRNA表达及蛋白含量均较对应实验组减少、减弱，RVSP、mPAP值降低，COPD并肺动脉高压干预组RV/LV+S值降低，肌化型动脉WT%、WA%比值下降，提示肺血管重构得到不同程度的改善。

综上所述，NF-κB的表达与大鼠COPD疾病的发展关系密切，在肺血管重构中有相当重要的作用，早期利用PDTC干预NF-κB表达可抑制COPD肺血管重构。与COPD阶段不同的是，在慢支模型组中未检测到肺组织NF-κB异常表达，究其原因，可能与检测时间为第二次气道内注入脂多糖2周之后，以及机体的负反馈调节有关。NF-κB在COPD发病过程中有不可忽视的作用，NF-κB抑制剂PDTC可在一定程度上抑制COPD肺血管重构，延缓COPD疾病的进程，其联系有可能成为COPD疾病新型抗炎类药物的作用靶点，为临床治疗开拓新方向，但其具体机制仍有待进一步研究及探讨。

图4 肺组织NF-κB Western blot电泳图

A：正常对照组；B：慢支组；C：COPD组；D：COPD并肺动脉高压组；E：慢支干预组；F：COPD干预组；G：COPD并肺动脉高压干预组