若存

1.湖南国华制药有限公司，湖南 长沙 410013；2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410013；3.湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭 411102

玄麦利咽口服液系由玄参、麦冬、射干、桔梗、诃子等多味药材研制而成的中药6类新药，具有滋阴清热、散结利咽功效，用于热盛津伤，热毒内盛所致的口干、咽痛、咽部有异物，分泌物不易咳出，干燥感、刺激感及失音等症。为了有效地控制其内在质量，对方中的主要药材玄参、桔梗、诃子分别进行了TLC薄层鉴别，对射干中的次野鸢尾黄素采用高效液相色谱法进行了含量测定[1]。本文建立的TLC薄层鉴别方法与HPLC测定含量的方法为玄麦利咽口服液的质量控制提供了依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(LabSolution色谱数据处理软件，日本岛津)；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)。

1.2 材料 玄参(批号：121008-201308)、桔梗(批号：121028-201612)、诃子对照药材(批号：121015-201605)、次野鸢尾黄素对照品(批号：111557-200602)均由中国食品药品检定研究院提供；玄麦利咽口服液由课题组提供，批号分别为：20170311、20170405、20170410、20170415、20171012、20171022、20171102。甲醇、磷酸均为色谱纯，其它试剂均为分析纯。2TLC鉴别[1]

2.1 玄参的TLC鉴别 分别取三个批号(20170405、20170410、20170415)的玄麦利咽口服液10 mL，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.2 cm，柱高20 cm)，用水洗脱至流出液无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液25 mL，蒸干，残渣加适量甲醇溶解，溶液加到中性氧化铝柱(100～200目，内径为1.2 cm，1.2 g，湿法上柱)上，再用甲醇15 mL洗脱，洗脱液浓缩至1 mL，分别作为供试品溶液。另取玄参对照药材1 g，加甲醇25 mL，浸泡1 h，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方取除玄参外的药材，照玄麦利咽口服液制备工艺制备缺玄参的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成缺玄参的阴性样品溶液。照TLC法试验，吸取上述5种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(12∶3.5∶1∶0.05)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且缺玄参阴性样品无干扰。见图1。

2.2 桔梗的TLC鉴别 分别取三个批号(20170405、20170410、20170415)的玄麦利咽口服液10 mL，水浴蒸干，浸膏分别加75%甲醇25 mL，20%盐酸2 mL，80 ℃加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，分别作为供试品溶液。取桔梗对照药材2 g，自加75%甲醇25 mL起，按供试品同法制成对照药材溶液。按处方取除桔梗外的药材，照玄麦利咽口服液制备工艺制备成缺桔梗的阴性样品，再按供试品方法制成缺桔梗阴性样品溶液。照TLC法试验，分别吸取上述5种液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙醚(2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺桔梗阴性样品无干扰。见图2。

2.3 诃子的TLC鉴别 分别取三个批号(20170405、20170410、20170415)的玄麦利咽口服液6 mL，通过处理好的聚酰胺柱(30～60目，内径为1 cm，柱高为15 cm，用水湿法上柱)上，先用水洗至流出液无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液25 mL，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，分别作为供试品溶液。另取诃子对照药材2 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方取除诃子外的药材，照玄麦利咽口服液制备工艺制备成缺诃子的阴性样品，再按供试品方法制成缺诃子的阴性样品溶液。照TLC法试验，吸取上述5种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶 g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(3∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与诃子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，缺诃子阴性样品无干扰。见图3。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验检测 波长：266 nm；色谱柱：TECHI C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液(53∶47)；柱温:室温；进样量：10 μL。流量：1.0 mL/min；在上述条件下测定，按次野鸢尾黄素峰计理论板数应不低于4000。

3.2 对照品溶液的制备 取次野鸢尾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含11.94 μg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备 精密吸取玄麦利咽口服液0.4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性样品的制备 按玄麦利咽口服液处方、工艺制备成缺射干阴性样品，再“3.3”项下方法制成缺射干的阴性样品溶液。

3.5 测定波长的确定 取次野鸢尾黄素对照品的甲醇溶液(C=11.94 μg· mL-1)，在紫外分光光度计200～700 nm波长间扫描。见图4。

3.6 专属性试验 按“3.1”项下设定的色谱条件， 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10 μL，注入液相相色谱仪，见图5。

3.7 线性关系考察 精密吸取次野鸢尾黄素对照品溶液(C=11.94 μg·mL-1)1、5、10、15、20 μL进样，测定其峰面积积分值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=6E+06x，r=0.9999。结果表明次野鸢尾黄素在0.01194～0.2388 μg范围内具有良好的线性关系。

3.8 稳定性考察 分别精密吸取供试品溶液于0、4、8、12、24 h进样，每次进10 μL，以次野鸢尾黄素峰面积积分值计，RSD为3.19%，结果说明室温条件下供试液24 h内稳定。

3.9 精密度考察 精密吸取“3.3”项下供试品溶液，重复进样6次，每次进10 μL，以次野鸢尾黄素峰面积积分值计，RSD为0.32%，表明仪器精密度良好。

3.10 重复性考察 取批号20170311样品，6份，按“3.3”项下制备，测定，计算次野鸢尾黄素含量，以含量计，RSD为1.55%，结果说明方法重复性好。

3.11 中间精密度试验 取批号20170311样品，6份，按“3.3”项下制备(由不同人员操作)，用不同的液相色谱仪进行测定，计算次野鸢尾黄素含量，以含量计，RSD为1.52%，结果说明中间精密度良好。

3.12 样品加样回收率试验 精密量取已知含量为0.236m g·mL-1的样品(批号20170311)溶液0.2 mL，6份，分别精密加入次野鸢尾黄素对照品溶液(12.05 μg.mL-1)4 mL，即0.0482 mg，按上述供试品溶液制备方法制备，测定含量，计算回收率，平均值为102.52%，RSD为2.85%。，结果见表1。

3.13 含量测定 取6批中试产品， 按上述方法测定，结果见表2。

表1 回收率测定结果

表2 含量测定 (n=3)

4 讨论

4.1 薄层鉴别 玄参为方中的君药，具有清热凉血、滋阴降火、解毒散结的功能，主要含环烯醚萜和苯丙素2大类成分，包括珊瑚苷、毛蕊花糖苷、苯乙醇苷、哈巴苷、哈巴俄苷、麦角甾苷、安格咯苷C等。上述成分是玄参抗炎、抗血小板聚集及调节免疫功能的主要有效成分[2-4]，由于本品其他药味含苷类成分多，鉴别时相互干扰，所以本试验采用D101型大孔树脂柱及氧化铝柱纯化供试品，去除了干扰成分，结果玄参特征斑点清晰，玄参阴性样品无干扰。桔梗为方中臣药，具有宣肺，利咽，祛痰，排脓的功能。主要成分为皂苷类，包括桔梗皂苷A、B、D，远志苷D、D2等成分，药理研究表明上述成分有抗炎、抗氧化、止咳祛痰作用[5-6]。本试验对供试品采用酸水解，三氯甲烷提取苷元的方法，结果桔梗特征斑点清晰，桔梗阴性样品无干扰。诃子为方中臣药，具有涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽的功能。主要含酚酸类，没食子酰葡萄糖类，其中以莽草酸、儿茶酸、没食子酸和糅花酸的含量较高。药理研究表明上述成分为抗病毒、抗炎、抗菌及抗氧化的有效成分[7-9]。本法依据诃子所含的酚性成分与聚酰胺形成氢键而与复方中干扰成分分离，结果诃子特征斑点清晰，诃子阴性样品无干扰。

4.2 含量测定

4.2.1 含量指标的选定 玄参与麦冬为方中君药，实验中曾对其主要成分进行了含量测定试验，结果表明阴性有干扰。射干为方中臣药，主要成分为黄酮类及三萜类化合物等，包括次野鸢尾黄素、野鸢尾黄素、德鸢尾素、鸢尾黄素、射干苷、野鸢尾苷、白射干素等约20个，其中次野鸢尾黄素为治疗咽痛喉痹的主要有效成分之一[10-11]，《中国药典》2015年版规定该成分为射干药材含量测定指标成分，因此选其作为本品质量控制指标。

4.2.2 样品的制备 文献报道复方制剂中对次野鸢尾黄素的纯化有很多种方法[12]，本试验比较了乙酸乙酯萃取法与本品直接取样经0.22 μm 滤膜过滤法，结果前一种方法提取不完全，而后一种方法简单，缺射干的阴性样品无干扰，因此选择了该法。

4.2.3 样品的测定 使用所建立的方法对6批中试产品进行次野鸢尾黄素的含量测定，结果表明本法方法准确、灵敏、简便、快速、重复性好，可作为本产品的质量控制方法。