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(榆林市第二医院心血管内科二病区，陕西 榆林 719000)

阿霉素(Adriamycin)是一类蒽环类的抗生素，具有广谱的抗癌活性，能减缓乳腺癌、肺癌、膀胱癌及甲状腺癌等癌症的发展进程，被广泛地应用于癌症的治疗，但其不良反应限制了阿霉素的应用[1-3]，其中心脏毒性是其最主要的不良反应。研究表明，连续2～3 d使用阿霉素即可造成心肌损伤[4]，最终可发展为心律不齐和心脏衰竭，甚至导致患者死亡[5],因此探究阿霉素诱导心肌损伤的机制，发现具有心肌保护作用的新药物是降低阿霉素不良反应的关键。有研究表明，自噬在调控心脏的结构和功能方面发挥了重要作用[6];也有研究表明，自噬是阿霉素诱导心肌细胞损伤的主要作用机制之一，异常的自噬可导致心肌细胞凋亡[7]。因此，抑制自噬可能有利于减轻阿霉素诱导心肌损伤。冬凌草甲素(Oridonin)是从中药冬凌草中提取的一类二萜类化合物，具有抗癌、抗菌、免疫调节及抗氧化活性，具有调控细胞自噬的作用[8-9]，但是否能通过调控自噬减轻阿霉素诱导的心肌细胞损伤还未见报道。本文采用阿霉素诱导心肌细胞凋亡并给予冬凌草甲素，探究冬凌草甲素对阿霉素诱导心肌细胞凋亡的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

大鼠心肌细胞细胞株H9C2由中国科学院上海细胞库提供。细胞培养液DMEM和胎牛血清购自美国Gibco公司。冬凌草甲素购自河南济世药业，纯度99.5%。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD，货号：A001-1-1)和丙二醛(malondialdehyde,MDA，货号：A003-1)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，CCK8试剂盒(货号：C0037)和Annexin V-FITC试剂盒(货号：C1063)购自碧云天生物技术公司。RIPA裂解液(货号：R0010)和BCA试剂盒(货号：PC0020)购自北京索莱宝科技公司。Beclin1(货号：ab207612)、P62(货号：ab109012)和LC3(货号：ab192890)一抗及实验所用二抗购自英国Abcam公司。

1.2 细胞分组及模型复制

用含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液将大鼠心肌细胞系H9C2细胞培养于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，隔天换液，细胞融化率达到85%以上时进行传代培养。将细胞随机分为H9C2组、Adriamycin组、Oridonin(5 μM)组、Oridonin(10 μM)组和Oridonin(20 μM)组，每组6个复孔。除H9C2组外，其余组加入阿奇霉素进行处理，使其终浓度为1 μM。同时，Oridonin(5 μM)组、Oridonin(10 μM)组和Oridonin(20 μM)组分别加入5 μM、10 μM和20 μM的冬凌草甲素，其余2组给予等量溶剂处理，48 h后进行相应检测。

1.3 试剂盒检测氧化应激分子的浓度

用冬凌草甲素处理细胞48 h后，收集细胞上清液，以1 000 r/min的转速离心4 min后取上清液根据试剂盒说明书检测细胞上清液中抗氧化酶SOD和氧化产物MDA的浓度。

1.4 CCK8检测细胞增殖

将细胞以1×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，同时加入1 μM的阿霉素和5 μM、10 μM、20 μM的冬凌草甲素分别处理0 d、1 d、2 d、3 d和4 d后，每孔加入10 μL的CCK8试剂，室温孵育4 h后，用酶标仪检测各组细胞吸光度，计算细胞增殖倍数(增殖倍数=细胞吸光度/0 h H9C2组细胞吸光度×100%)。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

用阿霉素和冬凌草甲素处理细胞48 h后，弃去细胞培养液，用缓冲液清洗细胞3次并用胰酶收集细胞，将细胞密度调整至1×106个/mL，用70%预冷的乙醇于4 ℃固定2 h后，加入PI染色液和FITC-Annexin V避光室温孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blot检测蛋白表达

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白并用BCA试剂盒检测蛋白浓度、调平。每组取等量蛋白，用10%SDS-PAGE分离蛋白，采用半干法将蛋白转移到PVDF膜，用5% BSA封闭蛋白，加入适宜浓度一抗4 ℃孵育过夜，第2天洗去未结合一抗 (Beclin1∶1∶1 200;P62,1∶1 000;LC3,1∶1 000)，加入二抗室温封闭1 h。随后洗去未结合二抗，滴加化学发光显色液于暗室曝光显影。

1.7 免疫荧光检测LC3表达

将用冬凌草甲素处理后的细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min，随后滴加TritonX-100对细胞膜进行打孔。15 min后弃去TritonX-100，滴加10%封闭用山羊血清，室温孵育2 h。封闭完成后，加入LC3一抗4 ℃封闭过夜，抗体浓度为1∶200。第2天洗去未结合一抗，加入FITC标记的荧光二抗(1∶300)室温孵育1 h，随后洗去未结合二抗，滴加DAPI即用液室温处理15 min，洗净后于荧光显微镜下观察染色情况。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 冬凌草甲素对氧化应激的影响

与H9C2组比较，Adriamycin组细胞上清液中抗氧化酶SOD的浓度显著降低，氧化产物MDA浓度显著升高；与Adriamycin组比较，Oridonin(5,10,20 μM)组SOD浓度明显升高，MDA浓度明显降低，表明冬凌草甲素能抑制阿霉素诱导的H9C2细胞氧化应激(图1)。

2.2 冬凌草甲素对细胞增殖的影响

与H9C2组比较，Adriamycin组细胞增殖速度明显降低；用冬凌草甲素处理细胞4 d后，Oridonin(5,10,20 μM)组细胞增殖速度与Adriamycin组比较均明显升高，表明冬凌草甲素能促进H9C2细胞增殖(图2)。

2.3 冬凌草甲素对细胞凋亡的影响

流式细胞术实验结果表明，阿霉素能显著提高H9C2细胞的凋亡率，冬凌草甲素(5,10,20 μM)能显著减弱阿霉素对H9C2细胞凋亡的诱导作用，表明冬凌草甲素能抑制心肌细胞凋亡(图3、4)。

a：SOD浓度；b: MDA浓度 *：与H9C2组比较，P<0.01；#：与Adriamycin组比较，P<0.05；△：与Adriamycin组比较，P<0.01

图1冬凌草甲素对上清液中SOD和MDA浓度影响

*：与H9C2组比较，P<0.01；#：与Adriamycin组比较，P<0.01；△：与Adriamycin组比较，P<0.01

图2冬凌草甲素对H9C2细胞增殖的影响

a:H9C2组;b:Adriamycin组;c:Oridonin(5 μM)组;d:Oridonin(10 μM)组;e:Oridonin(20 μM)组

*：与H9C2组比较，P<0.01；#：与Adriamycin组比较，P<0.05；△：与Adriamycin组比较，P<0.01

图4冬凌草甲素对H9C2细胞凋亡的影响

2.4 冬凌草甲素对自噬的影响

Western blot实验结果表明，与H9C2组比较，Adriamycin组细胞Beclin1表达水平和LCⅡ/LC3Ⅰ的比值明显升高，P62表达水平明显降低；与Adriamycin组比较，Oridonin(5,10,20 μM)组细胞Beclin1表达水平和LCⅡ/LC3Ⅰ的比值明显降低，Oridonin(10, 20 μM)组P62表达水平明显升高(图5)。同时，免疫荧光实验结果显示，Adriamycin组细胞LC3的表达量显著高于H9C2组，Oridonin(5,10,20 μM)组细胞LC3表达量明显高于Adriamycin组，表明冬凌草甲素能减弱阿霉素诱导的H9C2细胞自噬(图6、7)。

a:Western blot检测；b：蛋白相对表达量分析 *：与H9C2组比较，P<0.01；△：与Adriamycin组比较，P<0.01

图5Westernblot检测冬凌草甲素对Beclin1、P62和LC3蛋白表达的影响

图6 免疫荧光检测冬凌草甲素对LC3表达量的影响

*：与H9C2组比较，P<0.01；△：与Adriamycin组比较，P<0.01

3 讨论

阿霉素是一类蒽环类药物，临床常用于各类癌症的治疗，但因其具有较强的心脏毒性而限制了应用[10-11]。研究表明，15～25 mg/kg的阿霉素即具有心脏毒性，24 mg/kg及以上剂量的阿霉素可导致小鼠心脏严重损伤[12]。静脉连续给予癌症患者阿霉素数月可导致左心室重构，发展为慢性心肌病和充血性心力衰竭，导致患者死亡[13]。临床研究表明，心肌阿霉素积累量达到650 mg/m2的患者中有超过70%的患者都会发生充血性心力衰竭[3]。目前只能通过降低阿霉素使用剂量、终止阿霉素使用和与右雷佐生联用减轻阿霉素的心脏毒性[14]，并且还没有研究证明这些方法及药物既能显著改善阿霉素的心脏毒性又能不影响阿霉素的抗癌活性。因此，寻找降低阿霉素心脏毒性的新方法及新药物显得尤为重要。冬凌草甲素是中药冬凌草的有效成分之一，研究表明冬凌草甲素具有广谱的抗癌活性，并且能防止放射治疗的副反应，增强癌细胞对放疗的敏感性[15-16]。但冬凌草甲素是否能减轻抗癌药物阿霉素的心脏毒性还未见报道。本研究采用阿霉素直接诱导心肌细胞损伤并给予不同剂量的冬凌草甲素，以期探究冬凌草甲素对阿霉素心脏毒性的作用。

氧化应激是阿霉素诱导心肌损伤的主要机制之一。研究表明，阿霉素的使用可诱导线粒体活性氧的大量产生和心肌的损伤[17]。大量氧化自由基可造成细胞线粒体功能障碍和DNA损伤，导致细胞凋亡和坏死[18]。心肌细胞凋亡和坏死是导致心功能衰竭的最直接原因[19]。研究发现，中药提取物黄芪素能通过减轻心肌细胞氧化应激抑制小鼠心肌细胞凋亡，从而减轻阿霉素对小鼠的心毒性[20]。本研究发现，冬凌草甲素能显著升高阿霉素处理后细胞上清液中SOD的浓度，降低MDA的浓度。SOD是一类抗氧化酶，能够通过清除氧化自由基减轻氧化应激对机体的损伤。MDA是脂质过氧化过程中的一类重要的中间产物，与氧化损伤程度呈正相关，提示冬凌草甲素能减弱阿霉素诱导的心肌H9C2细胞氧化应激。此外，阿霉素还能显著抑制增殖、诱导凋亡，冬凌草甲素能减轻阿霉素对心肌细胞增殖和凋亡的作用，并具有剂量依耐性，表明冬凌草甲素能对抗阿霉素诱导的心肌H9C2细胞凋亡，并随浓度升高作用逐渐增强，提示冬凌草甲素可能具有减轻阿霉素化疗所带来的心脏毒性的作用。

自噬是清除蛋白质聚集体和受损细胞器的重要机制。在正常生理条件下，自噬可维持心肌细胞内环境的稳定，异常的自噬可导致心肌细胞细胞器损伤及心肌细胞的凋亡和坏死[21]。已有研究表明，自噬在阿霉素导致的心功能衰竭过程中发挥着重要的调控作用[22]。Beclin1是自噬体形成的重要调节蛋白之一，与LC3共同参与自噬体的形成[23]。研究表明，Beclin1在自噬体的形成的启动阶段发挥重要作用，能诱导LC3Ⅰ向LCⅡ转化，参与自噬溶酶体膜的延伸，指导自噬体的形成，因此常被作为自噬体形成的标志[24]。P62则主要参与蛋白质的泛素化，随着自噬的进行不断地被降解，表达水平与自噬呈负相关[24]。本研究中，Western blot和免疫荧光实验结果均表明阿霉素能显著升高心肌细胞H9C2的Beclin1蛋白表达水平和LCⅡ/LC3Ⅰ的比值，抑制P62的表达，表明阿霉素诱导了H9C2细胞自噬。冬凌草甲素能显著减弱阿霉素对Beclin1、LCⅡ/LC3Ⅰ和P62的调控作用，提示冬凌草甲素能抑制阿霉素诱导的自噬。

综上所述，冬凌草甲素能升高阿霉素处理后H9C2细胞上清液中SOD的浓度，降低MDA浓度，并促进H9C2增殖、抑制细胞凋亡；同时，冬凌草甲素还能显著减弱阿霉素对Beclin1、LCⅡ/LC3Ⅰ和P62的调控作用和阿霉素对LC3表达的促进作用，表明冬凌草甲素能抑制阿霉素诱导的心肌H9C2细胞氧化应激和自噬，从而抑制心肌细胞凋亡。本研究首次初步探究了冬凌草甲素对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡的作用和机制，提示冬凌草甲素可能改善阿霉素用于癌症患者治疗的不良反应，为临床减轻阿霉素心脏毒性副作用提供了新的潜力药物。