高圣风 刘爱勤 桑利伟 苟亚峰 孙世伟 王政 孟倩倩

摘 要 为考察生防菌株Bacillus subtilis VD18R19在香草兰上的定殖动态及其对香草兰根（茎）腐病的田间生防效果。首先通过荧光显微镜观测VD18R19在香草兰上定殖位点的空间分布情况，然后采用菌落计数方法分析该菌株在香草兰上定殖数量的时间变化动态；最后通过田间试验检测VD18R19在自然发病的条件下对香草兰根（茎）腐病的生防效果。结果发现：（1） VD18R19菌株在香草兰根系定殖数量最多，在叶片表面较少，在茎蔓表面最少；（2） 在灌根处理后的45 d中，该菌株在香草兰根系上定殖数量变动不大，定殖密度保持在106 CFU/g水平。（3） 在自然发病的情况下，该菌株对苗圃中香草兰根（茎）腐病的防效达67.08%，显著好于多菌灵和清水对照。此外，生防菌处理能够显著促进香草兰生长，新抽茎蔓长度相对清水对照增长70.34%。总之，生防芽孢杆菌VD18R19可以在香草兰根际长期高水平定殖，能够有效防控香草兰根（茎）腐病并对香草兰生长具有明显促进作用。

关键词 枯草芽孢杆菌 ；香草兰 ；定殖 ；生物防治 ；促生长

中图分类号 S476 ；S435.73 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.012

Abstract This study aimed to monitor the colonization dynamics of B. subtilis VD18R19 in vanilla and analyzed the biocontrol effect of the strain VD18R19 against fusarium wilt disease infecting vanilla. The colonization site distribution of the strain VD18R19 was monitored by fluorescence microscopy using Green Fluorescent Protein （GFP） mark. The temporal dynamic change of colonizing populations in vanilla were detected by plate count. The biocontrol of the strain VD18R19 against Fusarium wilt disease infecting vanilla naturally was tested in the field. The results showed that the most fluorescent cells of the strain VD18R19 were observed on the surface of the roots of vanilla， much less on the leaves， and few on the stem. The strain VD18R19 was colonized on the rhizosphere of vanilla at a high population level （106 CFU/g） without much change in the experiment within 45 days of treatment. In the nursery test， the disease severity in the strain VD18R19 treatment was significantly reduced when compared with that of the carbendazim treatment and water control， and it had a controlling efficiency of upto 67.08%. In addition， the strain VD18R19 treatment improved the vine growth of vanilla by 70.34%， as compared with the water control. In conclusion， the strain VD18R19 was well colonized in the root and performed good biocontrol activity against fusarium wilt disease infecting vanilla.

Keywords Bacillus subtilis ； vanilla ； colonization ； biocontrol ； growth promotion

生防芽孢桿菌具有广谱、高效、对逆境耐受性强、对环境友好等优点，是当前生防微生物的重要组成部分。研究发现，生防芽孢杆菌的防病效果与其在作物根际的定殖能力密切相关[1-2]。生防菌田间应用时，因为根际定殖能力差导致的病害防效下降或防治失败的现象常有发生[3]；Kamilova 等[4]报道荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）PCL1751的在番茄根际定殖能力下降后均对番茄根腐病的防效显著降低。Chinawoeng 等[5]发现对病原菌具有良好拮抗效果的绿针假单胞菌（P. chlororaphis）PCL1391在番茄根际定殖能力是该菌株发挥生防效果的前提条件之一。高圣风等和高毓晗等[6-7]分别研究发现，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168在被修复了sfp基因后，定殖能力显著上升，对番茄细菌性枯萎病和黄瓜镰刀菌枯萎病的防效均大幅上升。根际定殖能力已成为生防芽孢杆菌大规模商品化的重要制约因子[8]。

香草兰（Vanilla planifolia Andrews）是一种天然食品香料植物，被广泛应用于高端香烟、酒水、茶叶、香水等食品和化妆品行业，经济价值极高[9]。近年来，香草兰根（茎）腐病为害日益严重，严重影响了香草兰产业的发展[10-11]。由于化学农药防治容易造成环境污染和农药残留等问题，不利于可持续型生态农业发展，利用绿色高效的生防菌防控香草兰病害是减少化学农药用量的良好选择。Ramalingam 等[12]从香草兰根系中分离出多个产生拮抗物质的生防菌株，发现这些菌株在田间和温室中对香草兰根（茎）腐病具有良好的防效。曾会才等[13]从3株枯草芽孢杆菌（B. subtills）和3株木霉（Trichodema）中筛选到2株拮抗效果良好的生防菌，在室内盆栽试验中对香草兰根（茎）腐病和香草兰疫病均有着良好的防治效果。本研究室从香草兰根际分离出生防菌株B. subtills VD18R19，发现该菌株在对峙培养试验中对香草兰根（茎）腐病菌（Fusarium oxysporum）具有良好拮抗效果[14]，在香草兰病害生物防治上具有极佳的应用潜力。

但是，至今尚未有生防枯草芽孢杆菌在香草兰上定殖情况的报道。之前，我们已经将绿色荧光蛋白基因（gfp）转入生防菌B. subtills VD18R19，发现GFP标记在该菌株能够正常表达和稳定遗传[15]。本研究利用GFP标记检测了生防芽孢杆菌VD18R19在香草兰上的定殖位点和定殖数量；并通过田间试验分析该菌株在自然发病条件下对香草兰根（茎）腐病的生防效果。本研究揭示生防芽孢杆菌在香草兰上定殖状态及田间应用效果，有助于理解“生防菌-香草兰”互作形态，对高效生防菌的开发有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用生防菌B. subtilis VD18R19是本研究室自主分离鉴定获得[14]，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center， CGMCC）；VD18R19-gfp菌株是本研究室将GFP表达载体pAD43-25转入VD18R19而成，氯霉素抗性5 μg/mL[15]，保存于本研究室-80℃超低温冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 在香草兰上的定殖情况分析

将长宽高分别为80、40、15 cm的塑料中转箱洗净后在底部打2个直径2 cm的孔备用。将椰糠与蛭石按1∶1比例混合后浇透水，121℃条件下灭菌30 min，冷却后装入中转箱中作为种植基质，基质深度约5 cm。将健康香草兰扦插苗定植于基质上，每箱10株。放置于日光温室中培养，及时浇水保湿，生长1个月后备用。将GFP标记的生防菌株VD18R19-gfp接种到含氯霉素5 μg/mL 的LB培养基（酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，去离子水1 000 mL，121℃灭菌20 min）中37℃ 200 r/min条件培养12 h。菌液在8 000 g条件下离心2 min，弃上清，用无菌水悬浮菌体；重复离心悬浮一次，充分去除培养基。将菌悬液用无菌水稀释为浓度约为107 CFU/mL的处理液，对香草兰苗进行灌根和表面喷雾处理，每箱500 mL处理液。处理48 h后采集根、茎、叶，剪成小段放在载玻片上制成临时装片，使用倒置荧光显微镜（奥林巴斯IX73）在波长约498 nm的蓝色激光下检测生防菌在香草兰上的定殖情况，每个位置至少检测3个玻片，每个玻片至少检测5个视野。另外，分别于处理后 1、3、5、10、15、20、25、30、35、40和45 d时间点各取3株香草兰苗，分别将每株根系收集在一起用无菌水轻轻冲洗干净后称重，研磨均匀后通过稀释涂平板方法检测生防菌在香草兰根系的定殖数量。定殖数量检测所用平板均为含氯霉素5 μg/mL 的LB固体培养基。

1.2.2 田间生防效果分析

生防菌VD18R19菌种接种于LB培养基中，在37℃ 200 r/min条件下震荡培养12 h制备种子菌。种子菌以3%比例接种于Landy培养基（葡萄糖10 g， L-谷氨酸5 g，磷酸二氢钾1 g，七水合硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g， L-苯丙氨酸2 μg，硫酸锰5 μg， 五水合硫酸铜0.16 μg， 七水合硫酸亚铁0.15 μg，去离子水1 000 mL，用NaOH调节pH值至7.0，121℃灭菌20 min）中，在30℃ 180 r/min条件下发酵36 h 形成发酵液。将发酵液用无菌水稀释10倍，稀释液活菌浓度约为107 CFU/mL備用。选取香草兰苗圃作为试验场所，在香草兰茎蔓扦插于苗床7 d后，用生防菌VD18R19处理液对香草兰表面及其周围土壤进行喷雾处理，3个月后重复处理1次。分别以清水处理和80%多菌灵可湿性粉剂（生产厂家：上海乡村季风生物科技有限公司）1 000倍稀释液处理作为对照。每个处理均包含独立的3畦苗床，每畦育苗约60株，每畦为1个重复。每个重复每次处理液用量为5 L。按常规方法进行日常管理，每半个月检查自然发病植株，记录后及时清除病株。6个月后统计发病率、香草兰在苗圃期间新生茎蔓长度及新生茎蔓第2节的直径。每重复发病率=每畦发病株数÷每畦总株数×100%，每处理发病率=（重复1发病率+重复2发病率+重复3发病率）÷3×100%；防效=（对照发病率-处理发病率）÷对照发病率×100%。促生率=（处理平均值-对照平均值）÷对照平均值×100%。

2 结果与分析

2.1 生防菌在香草兰上的定殖动态

结果发现，生防菌VD18R19在香草兰根系和茎叶表面均可定殖；在根系根毛区和干枯气生根定殖数量最多，菌体聚集成片分布；叶表定殖数量较少，主要集中于叶片褶皱处和气孔位置，多以单菌体散列分布；在茎表面定殖数量很少，多以单个菌体定殖在细胞间隙处（图1）。对处理45 d内生防菌在香草兰根系上定殖菌量分析发现，定殖密度呈先略微上升再缓慢下降趋势，在处理后第10 天定殖密度最大（9.54×106 CFU/g），整个45 d的定殖密度均维持在106 CFU/g水平（图2）。

2.2 生防菌田间生防效果

结果显示，生防菌VD18R19处理的香草兰苗在成活率和长势上均明显好于多菌灵和清水处理（图3）。3个处理间的病害发生率均存在显著差异（p≤0.05），相对于清水对照，生防菌处理对香草兰根（茎）腐病的防效达67.08%，多菌灵处理仅为34.34%（表1）。此外，生防菌能够显著促进香草兰苗茎蔓生长，该处理的新抽茎蔓长度比清水对照增长70.34%，而多菌灵处理与清水对照间差异不显著。在茎蔓直径上，生防菌处理比清水对照略有增强，但差异不显著。

3 讨论与结论

有效定殖是生防菌在田间应用时发挥作用的重要前提。Sha等[16]发现，2株枯草芽孢杆菌应用于水稻后的20 d内，在叶片上定殖水平保持在5×106 CFU/g水平，并且能够提高水稻对抗稻瘟病能力。Fan 等[17]研究发现，用枯草芽孢杆菌9407浸泡处理刚萌发的西瓜种子，20 d后该菌株在西瓜根系和叶片内部的定殖水平分别在104 和103 CFU/g水平，对西瓜细菌性果斑病的防效达57.8%。Han等[18]发现，枯草芽孢杆菌Tpb55主要定殖于烟草根系的分裂区和伸长区，偏好于在细胞间隙定殖，在处理后30 d内该菌株在烟草根系的定殖水平保持在106 CFU/g左右，对烟草黑胫病的田间防效达59.34%。本研究发现，枯草芽孢杆菌VD18R19在香草兰的根毛区定殖数量最多，偏好于细胞间隙位置（图3），与前人在马铃薯、黄瓜、番茄等作物上的报道一致[19-21]。生防菌VD18R19在香草兰根系的定殖量远高于叶片，与之前研究该生防菌在胡椒上定殖情况一致[15]，说明该菌株适合生存于植株根部，为枯草芽孢杆菌VD18R19应用提供方向指导。枯草芽孢杆菌在植物根际定殖是一个复杂的过程，涉及到菌株的趋化、运动和产生生物膜等过程[22-24]，生防菌VD18R19在香草兰根系的定殖机制还有待于后续研究。

枯草芽孢杆菌能够产生多种抑菌次生代谢产物，包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、泛革素（Fengycin）、溶杆菌素（Bacilysin）等，能够通过拮抗病原菌、诱导系统抗性（induced systemic resistance， ISR）等机制防控植物病害。前期研究发现，生防菌VD18R19对香草兰根（茎）腐病菌（F. oxysporum）菌丝生长具有良好的拮抗效果[14]。最近，本研究室完成了该菌株的全基因组测序工作，从该菌株的基因组中发现了6个编码抑菌物质的基因簇，其拮抗范围涵盖真菌、细菌和病毒。本研究在田间试验中发现，生防菌VD18R19对香草兰根（茎）腐病的防效达67.08%（表1），推测拮抗机制应该是其主要防病机制之一。国内外报道表明，枯草芽孢杆菌产生的表面活性素（Surfactin）2，3-丁二醇（2，3-butanediol）等次生代谢产物能够诱导植物ISR[6，25]。但是生防菌VD18R19是否能够诱导香草兰ISR还需要在后续研究中深入探讨。

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