帅天姣　代海燕　张召弟

[摘要]目的 觀察β-榄香烯对链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）导致增殖性糖尿病性视网膜病变大鼠视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）水平的表达，探讨其对增殖性糖尿病性视网膜病变大鼠视网膜的可能作用机制。方法 选取80只Wistar大鼠，随机分为正常对照组（NC组）、STZ诱导成功的糖尿病模型组（DC组）、低剂量β-榄香烯给药组（BL组）与高剂量给药组（BH），各20只。给药组分别在手术显微镜下玻璃体腔内注射不同计量的β-榄香烯、苏木精-伊红染色，观察大鼠视网膜组织的病理学改变，取各实验分组中的视网膜切片，对VEGF采用免疫组织化学染色法，检测视网膜组织中VEGF的表达。结果 HE染色结果显示，NC组视网膜各组织结构显现清晰的层次，DC组较NC组视网膜变薄，且结构破坏，神经节细胞数减少；BL组较DC组略有提高；BH组视网膜结构较BL组有好转。免疫组织化学染色后，检测的各实验组视网膜结果显示，DC组、NC组、BL组、BH组大鼠VEGF阳性细胞核数目分别为（125.4671±8.4561）、（10.1324±2.0334）、（75.5123±7.6507）、（21.5364±1.7861）个，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 β-榄香烯可能成为治疗增殖期糖尿病性视网膜病变的新作用靶点，同时可以改善晚期糖尿病性视网膜病变的发展，延缓视网膜组织的进一步恶化。

[关键词]β-榄香烯；增殖性糖尿病性视网膜病变；血管内皮生长因子；链脲佐菌素

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）6（c）-0007-04

[Abstract]Objective To observe the effect of β-elemene on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in the retina of rats with proliferative diabetic retinopathy caused by streptozocin （STZ），to investigate its possible mechanism of action on retinopathy of rats with proliferative diabetic retinopathy.Methods A total of 80 Wistar rats were selected.They were randomly divided into normal control group （NC group），STZ-induced diabetes model group （DC group），low-dose β-elemene group （BL group） and high-dose group （BH group），20 rats in each group.In the administration group，different doses of β-elemene and hematoxylin-eosin staining were injected into the vitreous cavity under the surgical microscope respectively.The pathological changes of rat retina tissues were observed.Retinal slices from each experiment group were collected.Immunohistochemical staining was applied to VEGF，and the expression of VEGF in retinal tissues was detected.Results The results of HE staining showed that the tissue structure of the retina in the NC group showed a clear level.The retina was thinner in DC group than that in the NC group，and the structure was broken.The number of ganglion cells was reduced；the BL group had a slight increase compared with the DC group.The retinal structure in the BH group was better than that in the BL group.After immunohistochemical staining，the retinal results in each experimental group showed that the number of VEGF-positive nuclei in the DC group，NC group，BL group and BH group was （125.4671±8.4561），（10.1324±2.0334），（75.5123±7.6507），（21.5364±1.7861） respectively，differences between the groups were statistically significant （P<0.05）.Conclusion β-elemene may become a new target for the treatment of proliferative diabetic retinopathy.At the same time，it can improve the development of advanced DR and delay the further deterioration of retinal tissue.

[Key words]β-elemene；Proliferative diabetic retinopathy；Vascular endothelial growth factor；Streptozotocin

我国糖尿病患病率日益增加，糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是眼部的一种严重并发症[1]，可导致不可逆性的失明。β-榄香烯目前已在糖尿病肾病中被广泛研究并应用，但其对DR增殖期的影响国内外罕有研究涉及于此，且其对DR大鼠血管内皮生长因子（VEGF）的干预作用，研究者也罕有报道[2]。本研究主要通过观察β-榄香烯对链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）致DR大鼠增殖期视网膜中VEGF的干预影响，应用免疫组织化学染色检测VEGF的表达，从而进一步研究β-榄香烯对DR的整个疾病过程的进展和机制，以便日后在临床治疗中提供更科学的依据。

1材料与方法

1.1实验动物

选取80只清洁级Wistar大鼠，雌雄各一半，2个月龄，体重为160～200 g，由牡丹江医学院实验动物中心所提供。

1.2主要实验试剂

β-榄香烯（沈阳万爱普医药有限公司）；STZ（美国 Sigma公司）；VEGF一抗（武汉博士德生物有限公司）；血糖仪及血糖试纸（德国罗氏公司）。

1.3 DR大鼠的模型建立以及实验具体分组

选取实验级Wistar大鼠80只，隨机分为正常对照组（NC组）、糖尿病大鼠模型组（DC组）、低剂量实验组（BL组）、高剂量实验组（BH），每组均为20只。适应性喂养1周后，DR组、BL组和BH组在进食8 h后，一次性腹腔注射STZ（溶于新鲜配制的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液，pH 4.5）60 mg/kg，NC组以等量的枸橼酸缓冲液，同样一次性进行腹腔注射。注射后的72 h，采大鼠的鼠尾静脉血液，来获取其空腹的血糖数值，空腹血糖数值≥16.7 mmol/L，糖尿病性大鼠的模型就视为建立成功。自糖尿病模型建成后，每天固定时间段内，用高脂高糖饮食饲养DC组、BL组及BH组大鼠，NC组给予含0.02 ml/ml DMSO的生理盐水灌胃，持续进行16周。16周末次给药后BL组及BH组大鼠进行腹腔注射100 g/L水合氯醛0.01～0.02 ml，用以麻醉。所有实验大鼠腹腔麻醉后，双眼均用复方托品卡胺滴眼液散瞳，之后玻璃体腔内分别注射1、3 μl计量的β-榄香烯，继续饲养2周。

1.4取材处理

腹腔药物注射14 d后，将所有实验大鼠处死[3]，采用石蜡将其组织包埋，而后对所有大鼠的视网膜的石蜡模型进行切片[4]，用来行免疫组织化学染色和组织病理学染色，之后利用光学显微镜对各组织病理学的变化进行观察，同时观察视网膜中VEGF蛋白的表达程度[5]。

1.5指标测定

大鼠实验模型眼球浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中24 h，制成厚度为4 μm的视网膜组织切片，并用苏木精-伊红染色后，取光学显微镜对每组大鼠的视网膜组织形态变化进行观察。依照DAB和SP显色试剂盒操作方法，对组织切片进行免疫组织化学染色及DAB显色，再进行复染。最终，应用光学显微镜观察VEGF蛋白的表达情况[6]。在观察的显微镜下，如在视网膜细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒者，则计为阳性细胞。对于每张视网膜组织的石蜡切片，在阳性表达区域内，再随机选择5个无重叠的高倍视野区来平均计数视网膜中阳性细胞核数。

1.6统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1组织病理学检测

HE染色结果显示，NC组大鼠的视网膜细胞排列紧密且规则，各层组织结果清晰分明（图1）；DC组大鼠的视网膜与NC组大鼠视网膜相比较薄，且神经节细胞排列呈现不规则趋势并发生水肿，内界膜还可看到有不同程度的断裂情况（图2）；BL组与DC组相比略有改善（图3）；BH组的视网膜各组织结构基本正常，与DC组相比明显改善（图4）。

2.2免疫组织化学染色

NC组大鼠只在视网膜神经节细胞层的细胞核内可见到棕黄色或黄色颗粒，VEGF蛋白阳性细胞核数为（10.1324±2.0334）个（图5）；DC组大鼠视网膜神经节外核层、内核层及细胞层细胞核内均可见到棕黄色或黄色颗粒，VEGF蛋白阳性细胞核数为（125.4671±8.4561）个，与NC组相比较明显增加（图6）；BL组大鼠视网膜神经节内核层、细胞层细胞核内可观察到棕黄色或黄色颗粒，VEGF蛋白阳性细胞核数为（75.5123±7.6507）个，较DC组有所改善（图7）；BH组大鼠VEGF蛋白内核层可见极少量的棕黄色或黄色颗粒，其主要在视网膜神经节细胞层内进行表达，VEGF蛋白阳性细胞核数为（21.5364±1.7861）个，与DC组、BL组相比明显减少；各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）（图8）。

3讨论

DR是糖尿病并发症的常见疾病之一，也是眼部最为常见、最为严重的微血管疾病之一[7]。DR先是视网膜毛细血管周细胞的死亡，逐步发展为视网膜形成大片新生血管，最终牵拉导致视网膜脱离，视力丧失[8]。目前，多数研究者认为，视网膜细胞在高糖及缺氧的环境中进行过度、过多的氧化应激反应，会导致视网膜周细胞以及内皮细胞严重受损[8]。其中，凋亡又是DR发生、发展的关键因素[9]。视网膜组织的缺血、缺氧状态又同时导致视网膜基底膜增厚，毛细血管的管腔又因内皮细胞的水肿而变窄，甚至最终导致血管闭塞，而使血-视网膜屏障遭到破坏[10]。糖尿病病程越长，血-视网膜屏障破坏越严重[11]，视网膜缺血、缺氧的范围就越广泛。视网膜新生血管向玻璃体内不停地破裂延伸，使得玻璃体积血，随着病程的发展，最后引起牵引性的视网膜脱离[12]。

β-榄香烯为我国拥有自主知识产权的中药单体[13]，具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化、保护心血管及降血脂等重要药理作用，目前已被应用于糖尿病肾病的治疗中，但其对DR增殖期的影响国内罕有研究涉及于此[3]。

VEGF是针对血管内皮细胞有较高特异性的促有丝分裂原[14]，在促进内皮细胞和视网膜色素上皮细胞增殖方面起到关键作用，同时又可以增加血管的通透性。当视网膜组织处于高糖环境或缺氧环境下，视网膜VEGF的含量升高，使其表达过度[15]，从而引起视网膜毛细血管闭塞，形成无灌注[16]，最终导致视网膜毛细血管的内皮细胞大量凋亡，造成视网膜局部缺血，导致血-视网膜屏障损伤。β-榄香烯可以通过抑制VEGF引起的新生血管[17]达到抑制DR发展的作用。

综上所述，β-榄香烯可能成为治疗增殖期DR的新作用靶点，同时可以改善晚期DR的发展，延缓视网膜组织的进一步病变，对于治疗增殖期DR的药物选择提供了一个新的思路。

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（收稿日期：2018-03-05 本文编辑：祁海文）